利福昔明軟膏劑中藥物含量檢測方法的建立

查 娜 , 徐 飛 , 蔣玲玉 , 李秀波

(中國農業科學院飼料研究所 國家飼料藥物基準實驗室 ， 北京 海淀 100081)

奶牛蹄病是奶牛業常見的重要疾病之一,該病輕則引起奶牛跛行，重則引起奶牛生產性能下降甚至淘汰。引起奶牛蹄炎的主要致病菌是鏈球菌、大腸埃希菌、沙門菌和酵母菌等病原菌[1]，目前在臨床上治療方法主要是藥物溶液浸泡或者肌內注射普魯卡因青霉素等抗生素[2-4]。這些方法的弊端是只能改善牛的跛行癥狀，但不能從牛群中徹底消滅該病，此外藥物浸泡的方法也會對土壤和水體造成污染。利福昔明[5](Rifaximin)屬利福霉素類衍生物，是首個非氨基糖苷類半合成抗菌藥，具有局部給藥的獨特優勢：它口服不易吸收、安全、高效、低殘留且抗菌譜廣，對大多數環境菌有較好療效。在奶牛乳房炎和奶牛子宮炎癥的防治上具有較好的應用[6]。開發利福昔明局部給藥制劑對治療奶牛臨床疾病具有非常明顯的優勢，同時也可以有效預防用藥后耐藥性的產生，以達到預防和治療動物疾病，減少養殖業的經濟損失的目的，具有非常廣闊的應用前景。

本試驗室開發了一種奶牛蹄病局部用利福昔明軟膏劑。為了進一步評價該制劑的質量情況，本試驗開發并建立了該利福昔明軟膏劑中藥物含量的檢測方法，并應用于該制劑的穩定性試驗評價中。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜儀(Waters 2695)，購自美國Waters公司；色譜柱:WondaSil C18-WR 250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津公司；凡士林、丙三醇、羊毛脂，均購自國藥集團；利福昔明軟膏劑(15 g∶45 mg)， 由中國農業科學院飼料研究所國家飼料藥物基準實驗室自主研發；利福昔明對照品(含量為95.7%，批次為130542-200601)，購自中國藥品生物制品檢定所；利福昔明原料藥(含量為98.1%，批次為80621-91-4)，購自浙江思賢制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 利福昔明軟膏劑的制備 將利福昔明無菌粉經超微粉碎得到利福昔明無菌微粉，按比例加入凡士林[7]、乳化劑以及防凍劑溶劑，35 ℃條件下150 r/min 持續攪拌0.5 h后，加入利福昔明藥物，繼續攪拌1 h得最終制劑。

1.2.2 利福昔明軟膏劑中藥物含量方法建立

1.2.2.1 色譜條件 流動相A為甲醇，流動相D為0.1%(v/v)甲酸水溶液。程序梯度見表1；柱溫:40 ℃；進樣量:20 μL；檢測波長:276 nm。

表1 利福昔明的流動相梯度及流速Table 1 Mobile phase gradient and flow rate of rifximine

1.2.2.2 對照品工作溶液配制 精密稱取利福昔明對照品10.45 mg(相當于利福昔明10.00 mg)，將稱量的對照品用甲醇溶解稀釋，再轉移至100 mL容量瓶中，定容，最終制備成 100 μg/mL 的對照品工作液。分別取適量并用甲醇稀釋為60 μg/mL的工作液，進樣20 μL至液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。

1.2.2.3 樣品前處理 精密稱取利福昔明軟膏劑1.0 g(相當于利福昔明3.0 mg)于50 mL離心管中，加入乙腈25 mL，渦旋5 min，置于25 ℃超聲水浴中30 min，4 000 r/min離心5 min；將上清液轉移至50 mL 容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取上層溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖[8-9]。

1.2.2.4 系統適應性試驗 參考《中國獸藥典》(2015年版)附錄66要求，將供試品儲備液用流動相稀釋成濃度為60 μg/mL的溶液，取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄對稱因子、理論塔板數。將對照品儲備液稀釋成濃度為60 μg/mL的對照品溶液，取20 μL注入高效液相色譜儀，連續進樣5針，考察重復性。

1.2.2.5 方法專屬性 考察了空白流動相、空白輔料、對照品(60 μg/mL)及供試品(60 μg/mL)的方法色譜行為。

1.2.2.6 方法確證 通過檢測限、定量限、準確度、精密度和線性范圍共5個方面進行考察。采用逐步稀釋的方法[10]，按信噪比S/N≥3和S/N≥10計算檢測限和定量限；將利福昔明軟膏劑配方，配成高、中、低3個濃度的樣品(15 g∶54 mg、15 g∶45 mg、15 g ∶36 mg)，按照利福昔明軟膏劑含量測定所示方法處理樣品，日內測5次，共測5 d，通過計算回收率考察準確度；線性范圍是將利福昔明對照品制備成不同濃度的工作溶液，濃度分別為40、50、80、100、120 μg /mL和160 μg /mL，按照HPLC(高效液相色譜)法進行檢測[11]，以峰面積對濃度作線性回歸，求出回歸方程及相關系數；精密度考察是將利福昔明軟膏劑按照1.2.2.1的色譜條件和1.2.2.3的樣品處理方法，配制成濃度為60 μg /mL的溶液進行測定，以利福昔明峰面積計算回收率及變異系數。

2 結果

2.1 方法專屬性和系統適應性

2.1.1 方法專屬性 取空白流動相20 μL注入液相色譜儀，結果表明，空白流動相對檢測并無干擾。將凡士林、羊毛脂及丙三醇按照比例制成無藥物添加的空白輔料，按照1.2.2.3方法處理后取20 μL進行檢測，結果表明，空白輔料對藥物峰無明顯干擾。以1.2.2.2和1.2.2.3所述方法操作分別得到利福昔明標準品色譜圖(圖1)及利福昔明軟膏劑藥物主峰色譜圖(圖2)。從圖中結果可見，利福昔明主成分峰與其他色譜峰完全分離，說明方法專屬性良好。

圖1 利福昔明標準品溶液色譜圖(60 μg/mL)Fig.1 Solution chromatogram of rifaximin standard(60 μg/mL)

圖2 利福昔明供試品溶液色譜圖(60 μg/mL)Fig.2 Chromatogram of test product solution(60 μg/mL)

2.1.2 系統適應性 結果如表2所示，主峰出峰時間為10.308 min，峰面積為1 736 363，對稱因子在0.9～1.1，連續進樣5針，所得RSD為0.23%，該方法系統適應性良好。

表2 系統適應性結果Table 2 Results of system adaptability

2.2 方法檢測限與定量限 采用逐步稀釋的方法，按信噪比S/N≥3計算，檢測限LOD值為0.2 μg/g，按信噪比S/N≥10計算，定量限LOQ值為0.6 μg/g。

2.3 方法準確度與精密度 理論上分別稱取原料藥54、45、36 mg，配制成高、中、低3個濃度的樣品，按照日內測5次，日間測5次的方法，所得平均回收率分別為100.12%、98.16%和95.94%，日間變異系數分別為3.10%、2.59%和3.93%，準確度和精密度試驗結果如表3所示。

表3 準確度和精密度試驗結果Table 3 Experimental results of accuracy and precision

2.4 方法的線性關系 按照HPLC法進行檢測，以利福昔明峰面積對利福昔明濃度作線性回歸，求出回歸方程Y=-9 378.26X+24 821.86，相關系數r2=0.999。利福昔明軟膏劑在40～160 μg /mL 濃度范圍內線性關系良好，如圖3。

圖3 利福昔明標準曲線Fig.3 Rifaximin standard curve

3 討論

3.1 流動相的選擇 利福昔明藥物含量檢測方法主要采用高效液相色譜法，目前采用較多的方法是歐洲藥典EP 8.0[12]，主要采用276 nm檢測波長，甲酸銨甲醇等度洗脫條件。在試驗中發現，由于其成分含鹽，極易造成色譜柱堵塞[13]，增加了儀器維護成本。因此，本試驗優化了利福昔明檢測方法，建立了一種不含鹽的流動相體系，主要采用乙腈∶0.1%甲酸(v∶v)，與EP 8.0方法相比，該方法的峰面積更大，峰高更高，響應更好，峰型較為尖銳。

3.2 檢測波長的選擇 本試驗從190～400 nm進行全波長掃描，發現波長233.7～293 nm處檢測響應較好，基于以上結果，分別選擇了239 nm及276 nm作為檢測波長，考察其對供試品及對照品的波形、響應、雜質的檢測，結果表明，239 nm波長下的響應高于276 nm，但波形在14.00～20.00 min內出現基線漂移。故選擇276 nm為本檢測方法的檢測波長。

3.3 結果 該HPLC法線性良好，在40～160 μg/mL濃度范圍內，藥物濃度與峰面積呈線性相關。高、中、低3個濃度的平均回收率分別為 100.12%、98.16%、95.94%，日間變異系數分別為 3.10%、2.59%、3.93%，表明該法的準確性和精密性良好，本文建立了檢測利福昔明軟膏劑含量的HPLC方法。該方法檢測限為0.2 μg/g，定量限(LOQ)為0.6 μg/g，以 80、100、120 μg /mL 3個濃度水平進行添加回收，回收率在95.94%～100.12%，日內變異系數在1.45%～3.51%，日間變異系數<3.93%。