共表達雞傳染性法氏囊病病毒LX株VP2基因及雞新城疫病毒PX02/3株F基因的重組火雞皰疹病毒的構建

王子書 ， 王 萍 ， 許 健 ， 楊大為 ， 李永清 ， 江 波

(1.江西農業大學動物科學技術學院 ， 江西 南昌 330045 ； 2.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097 ； 3. 北京市農林科學院畜禽疫病研究中心 ， 北京 海淀 100097)

雞新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性且高度傳染性的疾病，是危害養禽業的最重要疾病之一[1]。NDV的表面糖蛋白F蛋白在調節病毒與受體細胞膜的融合以及病毒向體內的入侵中起關鍵作用，此外，F蛋白存在多處抗原位點能誘導機體產生中和抗體，使機體產生保護性免疫應答，是開發NDV亞單位疫苗的主要候選蛋白[2]。

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是危害養禽業健康發展的重要免疫抑制病，傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)是引起雞傳染性法氏囊病的病原[3]。VP2是IBDV的主要結構蛋白，與病毒毒力和細胞嗜性有關，同時VP2也是IBDV最主要保護性抗原，能誘導機體產生中和抗體[4]。有研究表明，IBDV VP2特異性抗體水平和保護率呈直接相關關系[5]。利用VP2蛋白制備疫苗能夠有效預防和控制IBDV。

馬立克病(Marek’s disease,MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起雞的高度接觸性傳染病，其高死亡率對家禽業的健康發展構成嚴重威脅[6]。火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)是從火雞中分離得到的血清3型MDV，對雞無致病性，宿主范圍窄，具有良好的安全性和與MDV的交叉保護作用。它在雞群中不能通過接觸而發生水平傳播，但可以在雞體內持續存在，有利于外源基因的持續表達，并刺激機體產生更高的抗體水平。此外，HVT作為活病毒載體，有足夠大的基因組，其復制非必需區可容納較大的外源基因片段的插入，而不會影響其自身的復制和生物學特性，是比較理想的活病毒載體[7-9]。因此，HVT可以用作馬立克病良好的異源疫苗。

本研究在HVT基因組的非必需區分別插入IBDV LX株VP2基因和NDV PX02/3株F基因的獨立表達盒，其中VP2基因置于CMV啟動子控制下，F基因表達盒使用了pec啟動子，利用細菌人工染色體(BAC)技術和病毒拯救技術獲得了同時表達NDV和IBDV保護性抗原基因的重組HVT病毒，為進一步研制同時防控雞傳染性法氏囊病、新城疫與馬立克病的重組活載體疫苗以期降低疫苗使用成本，實現“一針多防”提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 質粒、病毒、細胞及工程菌 用于構建表達盒的真核質粒pVAX1和pCAGGS，購自美國Invitrogen公司；IBDV LX株為北京市農林科學院畜牧獸醫研究所分離鑒定；基因VII型NDV PX02/3株由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所贈送；HVT FC126株，購自中國獸醫藥品監察所；含HVT-galk BAC質粒的大腸桿菌EL250株由本課題組保存。

1.2 主要試劑 限制性內切酶和T4 DNA連接酶，購自New England Biolabs安諾倫(北京)生物科技有限公司；Pfx高保真聚合酶、零背景快速連接試劑盒和感受態大腸桿菌細胞Top10，均購自天根生化科技(北京)有限公司；DL-2 000及DL-15 000 DNA marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒，購自QIAGEN 公司；DMEM、opti-MEM和脂質體Lipofectamine 3000，均購自美國Invitrogen公司。

1.3 IBDVVP2及NDVF基因的克隆及序列優化 提取IBDV和NDV的病毒總RNA，反轉錄獲得cDNA后分別以IBDVVP2基因特異性引物(5′-ATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3′，5′-CCTTATGG- CCCGGATTATGTCT-3′)和NDVF基因特異性引物(5′-CTCGAGATGGGCCCCAAATCTTCTACCAGG-G-3′，5′-CTCGAGTCACGCTCTTGTAGTGGCTCTCATC-3′)擴增IBDVVP2基因片段(1.35 kb)和NDVF基因片段(1.68 kb)，同時設計引物在基因5′端引入Kozak序列(GCCACCAUGG)。

利用酶切位點KpnI/EcoR I和EcoR I/XhoⅠ將上述基因片段分別克隆到真核表達質粒pVAX1和pCAGGS中，構建重組表達質粒，命名為pVAX-VP2和pCAGGS-F。

1.4 重組HVT的轉移載體pHVT-UL45-46及pHVT-US1-10 的構建 以HVT FC126株的基因組DNA為模板分別擴增HVT的復制非必需區US1和US10，并在US1的下游引入SalⅠ酶切位點及US10上游引入Hind Ⅲ酶切位點。采用重疊延伸PCR(Overlap extension PCR,OE-PCR)方法將US1與US10連接在一起，同時在US1與US10之間增加酶切位點SalⅠ/Hind Ⅲ，在US1片段上游與US10下游增加NotⅠ酶切位點。獲得片段US1-SalⅠ-Hind Ⅲ-US10。同樣的方法獲得片段UL45-PacI-UL46。將上述片段分別克隆到pGEMT-Easy質粒(Promega公司)構建成重組質粒，并使它們的5′和3′端均帶有NotⅠ酶切位點。重組質粒經測序正確后確定為轉移載體。

1.5 攜帶IBDVVP2基因的重組HVT的轉移載體構建 根據真核表達質粒pVAX的已知序列設計兩端均帶有PacI酶切位點的引物，從重組真核表達質粒pVAX-VP2中擴增出表達盒CMV-VP2-BGH基因片段，并在其兩端引入PacI酶切位點；再將真核表達盒基因片段連接到pMD18-T載體，構建pCMV-VP2-BGH；PacI酶切pCMV-VP2-BGH及pHVT-UL45-46，然后將它們進行連接，獲得重組轉移載體pHVT-UL45-VP2-UL46。

1.6 攜帶NDVF基因的重組HVT的轉移載體構建 利用SalⅠ和Hind Ⅲ限制性內切酶分別酶切含NDVF基因的真核重組質粒pCAGGS-F及重組HVT的轉移載體pHVT-US1-10質粒，獲得pec-NDV F-polyA的表達盒及帶SalⅠ和Hind Ⅲ限制性內切酶位點的線性化pHVT-US1-10基因片段，再將上述基因片段進行連接，獲得重組轉移載體pHVT-US-F。

1.7 攜帶IBDVVP2基因的重組HVT細菌人工染色體(BAC)的構建 將轉移載體pHVT-UL45-VP2-UL46采用NotI酶切后，膠回收酶切片段UL45-CMV-VP2-BGH polyA-UL46并測定濃度，同時將含HVT-galk BAC質粒的大腸桿菌EL250制備感受態細胞。將上述酶切產物加入感受態細胞中進行電轉化。將電轉化后的感受態細胞涂布到galk陰性篩選板(DOG板)上置于培養箱中培養，挑取單克隆采用VP2的特異性引物進行PCR鑒定，將鑒定陽性的單克隆進行純化和進一步鑒定，即以UL45、UL46引物PCR鑒定表達盒插入的位置是否正確，從而獲得HVT-VP2-BAC。最后提取重組HVT BAC的DNA，在鑒定其完整性后保存備用。

1.8 HVT-VP2-galk BAC的制備 利用設計帶有HVT US1-10基因區中間位點兩端序列的引物(5′-CATGCTGAAATGGGTAATCGCCTTATGAACATTAT-GTACTGGTGTTGCTTGGGACACGCCTGTTGACAATT AATCATCGGCA-3′；5′-TCTAATAAACTTAAAATGGC CTGATTCGTCTCGTACAACTGCCATATCGAGCATCA GCACTGTCCTGCTCCT-3′)對質粒pSK-galk進行galk基因的擴增，使galk基因的兩側分別帶有 50 bp 的HVT US1-10基因序列；同時將已構建的含HVT-VP2-BAC質粒的大腸桿菌EL250制備感受態細胞，然后將純化的galk基因的PCR產物電轉化到含HVT-VP2-BAC的感受態細胞中。將電轉化后的感受態細胞涂布在galk陽性篩選板上培養3 d后，以galk特異性引物篩選陽性克隆子，從而獲得含HVT-VP2-galk BAC質粒的大腸桿菌EL250。

1.9 重組HVT-VP2-F BAC的構建 利用NotI酶切重組轉移載體pHVT-US-F的質粒，膠回收酶切片段US1-pec-F-polyA-US10；同時以1.8構建的含HVT-VP2-galk BAC質粒的大腸桿菌EL250制備感受態細胞，同樣將上述酶切片段電轉化到含HVT-VP2-galk BAC細菌中，利用基因同源重組現象，使表達盒基因CAG-F-polyA替換了HVT-VP2-galk BAC中的galk基因，從而獲得重組HVT-VP2-F BAC克隆。以NDVF基因的特異性引物對上述克隆子進行篩選和鑒定。

1.10 重組病毒rHVT-VP2-F的拯救 提取HVT-VP2-F BAC DNA，用LipofectamineTM3000脂質體轉染試劑轉染雞胚成纖維(CEF)細胞，轉染后置37 ℃ CO2培養箱培養3～5 d，經2～3次盲傳后，可以觀察到典型的HVT細胞病變(CPE)。收集有HVT病變的CEF細胞，一部分按常規方法進行液氮凍存，另一部分用于進行重組病毒的鑒定，進一步采用抗HVT雞血清對重組病毒進行空斑染色和計數，以測定重組HVT的病毒滴度。

1.11 重組病毒rHVT-VP2-F的鑒定 取病變重組病毒總DNA，PCR檢測VP2和F基因；取病變的細胞加入6×Loading buffer后煮沸5 min，分別以抗VP2蛋白單抗(1∶5 000)和抗NDV雞血清(1∶500)為一抗，利用Western Blot檢測重組病毒中外源蛋白VP2和F的表達；將重組病毒接種6孔板的CEF細胞，培養3 d 后，分別采用抗IBDV雞血清(1∶100)和抗NDV雞血清(1∶200)進行間接免疫熒光(IFA)檢測VP2蛋白和F蛋白的表達。

重組三聯病毒構建流程圖見中插彩版圖1。

2 結果

2.1 攜帶IBDVVP2基因和NDVF基因的重組HVT的轉移載體 將獲得的重組轉移載體pHVT-UL45-VP2-UL46用PacI限制性內切酶可將轉移載體酶切為大約6 000 bp和2 000 bp的片段，與預期結果一致(圖2A)。將獲得的重組轉移載體pHVT-US-F用NotI進行酶切鑒定。結果顯示，NotI能將該重組轉移載體酶切成約6 000 bp和3 000 bp的片段，與預期大小一致(圖2B)。

圖2 重組轉移載體pHVT-CMV-VP2-BGH、重組轉移載體pHVT-US-F的PCR鑒定Fig.2 PCR of recombinant transfer vector pHVT-CMV-VP2-BGH and recombinant transfer vector pHVT-US-FA：Pac I酶切鑒定結果； M：DNA標準分子量DL-15 000； 1：Pac I酶切產物； B：Not I酶切鑒定結果； M：DNA標準分子量DL-15 000； 1：重組質粒； 2：Not I酶切產物A:The result of Pac I digestion; M:DL-15 000 marker; 1:Digested products of Pac I; B:The result of Not I digestion; M:DL-15 000 marker; 1:Recombinant plasmid; 2:Digested products of Not I

2.2 重組HVT-VP2 BAC的構建 將DNA片段UL45-CMV-VP2-BGH-UL46(約4 000 bp)電轉化含HVT-galk BAC的大腸桿菌感受態細胞。轉染后細菌在DOG選擇培養平皿上生長5 d后，利用IBDVVP2引物進行重組克隆菌株的篩選，結果有3個菌落能被擴增出約1 400 bp的目的片段(圖3)。

圖3 重組HVT-VP2 BAC的PCR鑒定Fig.3 PCR of recombinant HVT-VP2 BACM：DNA標準分子量DL-2 000； 1～5：重組HVT-VP2 BAC的PCR產物M:DL-2 000 marker; 1～5:PCR products of recombinant HVT-VP2 BAC

2.3 重組HVT-VP2-F BAC的構建 將NotI酶切的DNA片段US1-pec-F-polyA-US10轉染到按1.8構建的含HVT-VP2-galk BAC大腸桿菌感受態細胞中，復蘇后的細菌在DOG培養板生長3～5 d后，挑取單個菌落以NDVF基因的引物篩選陽性重組子。結果有4個菌落能被擴增出約1 700 bp的目的片段(圖4)。

圖4 HVT-VP2-F BAC的PCR鑒定Fig.4 PCR of recombinant HVT-VP2-F BACM： DNA標準分子量DL-2 000； 1～11：重組HVT-VP2-F BAC的PCR產物M:DL-2 000 marker; 1～11:PCR products of recombinant HVT-VP2-F BAC

2.4 重組病毒rHVT-VP2-F的體外生物學特性鑒定

2.4.1 PCR鑒定重組病毒IBDVVP2及NDVF基因的整合 以P3代重組病毒rHVT-VP2-F感染CEF，待出現典型的細胞病變后，提取病毒感染的細胞DNA，首先要確定目的基因VP2和F是否整合到靶細胞的基因組中，因此提取獲得的病毒的總DNA，分別以IBDVVP2以及NDVF的特異性引物進行擴增，并以galk基因的特異性引物作為對照。結果顯示，rHVT-VP2-F能擴增出大小約1 700 bp的NDVF基因片段以及1 400 bp的IBDVVP2基因片段，均與預期相符，而galk特異性引物不能擴增出任何片段(圖5)，說明IBDVVP2以及NDVF同時整合到重組HVT基因組中，并在病毒感染的細胞中復制。

圖5 重組HVT-VP2-F的PCR鑒定Fig.5 PCR of recombinant HVT-VP2-FM:DNA標準分子量DL-2 000； 1：IBDV VP2引物擴增產物； 2：NDV F引物擴增產物； 3：galk引物擴增產物M:DL-2 000 marker; 1:Amplification products of IBDV VP2 primer; 2:Amplification products of NDV F primer; 3:Amplification products of galk primer

2.4.2 Western Blot鑒定重組病毒感染CEF后外源基因的表達 將rHVT-VP2-F第3代細胞毒感染的CEF進行Western Blot鑒定。一抗用IBDV VP2單抗和抗NDV雞血清，結果顯示，條帶大小與預期蛋白大小相符，大小約50 kDa和65 kDa。而親本HVT感染CEF對照則未見任何反應條帶，說明重組rHVT-VP2-F感染CEF后表達了IBDV VP2蛋白和NDV F蛋白(見中插彩版圖6)。

2.4.3 IFA鑒定重組病毒rHVT-VP2-F感染CEF后外源基因的表達 將rHVT-VP2-F第3代病毒接種CEF，待細胞出現50%的病變后，固定CEF分別以抗IBDV雞血清及抗NDV雞血清為一抗進行IFA鑒定。結果表明：2種血清均能結合rHVT-VP2-F感染CEF，并在倒置熒光顯微鏡下觀察到典型的黃綠色熒光的空斑(見中插彩版圖7)。

2.4.4 重組病毒rHVT-VP2-F生長形態及滴度的測定 將重組病毒rHVT-VP2-F按照10-3、10-4和10-5三個稀釋度接種CEF細胞4 d后，進行蝕斑試驗檢測。重組病毒rHVT-VP2-F和親本HVT產生的蝕斑形態沒有明顯差別(見中插彩版圖8)，分別感染CEF 4 d后檢測病毒滴度，親本HVT病毒為1×105PFU/mL，重組病毒rHVT-VP2-F為9.5×104PFU/mL，兩者無明顯差異。

3 討論

雞新城疫、傳染性法氏囊病以及馬立克病均具有高發病率和高死亡率的特點，對養禽業危害巨大，嚴重威脅我國養禽業的健康發展。疫苗免疫是預防和控制這3種疾病最有效的措施。然而，傳統疫苗是一種疫苗只能預防一種疾病。因此，研發一種既安全又有效的三價疫苗可同時預防這3種疾病，對實際生產具有重大意義。

基因工程重組活載體疫苗是利用基因工程技術將一種或幾種病原的保護性抗原基因插入到活載體中。并使之在體內表達出保護性抗原的活疫苗，包括重組細菌載體活疫苗和重組病毒載體活疫苗[10]。該疫苗具有很多優點：首先，它可以降低生產成本，更廉價地批量生產；其次，易于區分感染動物和免疫動物；再者，可以使用活載體制備多價疫苗，達到一針防多病的目的。皰疹病毒的基因組龐大，有許多復制非必需區，并且具有很強的容納外源基因的能力，可以插入多個外源基因，而且遺傳穩定，受母源抗體影響較小，是良好的重組疫苗載體[12]。HVT活載體疫苗是基因工程疫苗研究的熱點，被認為是構建表達外源抗原基因并誘導產生保護性免疫的多價重組活疫苗最有效的載體之一，是安全有效的抗MDV疫苗。目前，重組皰疹病毒的構建主要基于BAC的感染性克隆，對病毒的基因組采用重組工程技術進行修飾[11]。普遍使用的方法是將HVT基因組克隆細菌人工染色體(BAC)中，利用反向遺傳操作，使病毒的保護性抗原基因快速定向地插入到HVT基因組中[7]。HVT作為家禽疫苗載體具有良好的應用前景，新城疫、傳染性法氏囊病等多種禽病保護性抗原均已在HVT載體中成功表達，重組HVT(rHVT)疫苗在美國、巴西等國家已被廣泛使用[13-14]。機體產生免疫應答主要依靠抗原表位，制備基因工程疫苗時截取主要抗原表位更有利于疫病的防控。劉紅梅等[15]將VP2基因插入CVI988疫苗株的非必需區US10片段中，成功表達VP2蛋白，攻毒保護試驗表明，構建的表達IBDV VP2蛋白的rMDV可以使機體產生保護性免疫應答。Kenji等[16]通過在CVI-988疫苗株的US2位點表達VP2抗原，可以構建安全且有效的重組皰疹病毒的IBD亞單位疫苗。Liu等[2]利用干酪乳桿菌表達系統表達NDV F部分主要抗原表位蛋白，免疫保護試驗和攻毒保護性試驗表明，重組干酪乳桿菌pLA-NDV-F/L.casei能為機體提供免疫保護作用。

本研究以HVT為載體，利用同源重組的方法，選擇UL45-46非必需區和US1-10非必需區作為外源基因的插入位點，構建表達IBDVVP2基因和NDVF基因的重組病毒rHVT-VP2-F。分別以IBDVVP2基因和NDVF基因的特異性引物對重組病毒進行篩選和鑒定，采用抗HVT雞血清對重組病毒進行空斑染色和計數，以測定重組HVT的病毒滴度。IBDVVP2和NDVF基因能否在重組病毒感染的CEF中表達并獲得抗原性蛋白，對其免疫后是否產生保護力至關重要，將rHVT-VP2-F第3代細胞毒感染的CEF進行Western Blot和IFA鑒定，結果顯示，VP2和F蛋白獲得表達。本研究構建的重組病毒，為研究rHVT-VP2-F三聯活載體疫苗提供候選病毒株提供了科學依據。