黃柏蒼術湯對急性痛風性關節炎鼠模型抗炎作用的研究

楊 虹 羅 干 熊梓汀 李巧玲 陳雄斌 王 勇

痛風是由于體內嘌呤代謝紊亂，尿酸排泄減少，體內持續高尿酸狀態，引起過飽和的尿酸析出沉積于組織或器官的一種非特異炎性反應[1]。常累及關節，致反復發作性的關節炎；腎臟引發慢性腎間質性腎炎和尿路結石等。急性痛風性關節炎臨床上常表現為突發的關節紅、腫、熱、痛及功能障礙，好發部位多見于第一跖趾關節、踝關節、膝關節[2]。對于該病的治療中西醫采取的方式有所不同，西醫一線用藥主要為秋水仙堿、非甾體消炎藥、激素等，能夠起到迅速控制癥狀的作用，但是同時也存在著一定的弊端，如不良反應大，有些患者藥物依賴性差等[3，4]。中醫藥治療痛風在我國已有悠久的歷史，而黃柏蒼術湯在中醫藥治療痛風中有一定的臨床療效，但其作用機制目前尚不明確[5，6]。本研究通過觀察不同濃度黃柏蒼術湯對急性痛風性關節炎模型大鼠的治療后關節腫脹值的動態變化及治療后關節液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的變化，初步探討黃柏蒼術湯治療急性痛風性關節炎的可能機制。

材料與方法

1.藥物與試劑：黃柏倉術湯的主要組成成分：黃柏10g、蒼術10g、制天南星10g、桂枝10g、威靈仙15g、防己15g、桃仁10g、紅花10g、龍膽草10g、茯苓15g、萆薢12g[6]。水煎濃縮待用。臨用前用0.8% CMC-Na稀釋。秋水仙堿懸液是由云南昆明制藥集團生產的秋水仙堿片研磨呈粉末狀后溶于蒸餾水形成濃度為0.01mg/ml的混懸液。尿酸購自美國Sigma公司。TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6 ELISA檢測試劑盒均購自深圳欣博盛有限公司。

2.實驗動物：SPF級雄性SD大鼠48只，體質量為200～240g，均為3月齡。所有動物均由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供。飼養溫度21～27℃，濕度50%±5%，晝夜光照及通風環境自然調節。實驗程序嚴格按照動物管理章程。

3.主要儀器：酶標儀(美國Bio-Rad公司)，FA2004B型電子天平(上海越平科學儀器有限公司)，移液槍(美國Thermo Fisher Scientific公司)，低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

4.尿酸鈉懸液的制備：稱取80mg尿酸鹽晶體，加入無菌PBS溶液中，制成終濃度為80mg/ml的尿酸鹽混懸液。以上操作均在無菌操作臺中進行。

5.實驗動物的造模與給藥：48只大鼠在開放的實驗環境下飼養1周后，隨機分為模型組、黃柏蒼術高劑量組、黃柏蒼術中劑量組、黃柏蒼術低劑量組、秋水仙堿組、正常組，每組各8只大鼠。對各組大鼠進行吸入乙醚麻醉后，在無菌條件下以右踝關節外側后方為穿刺點，除正常組注射PBS外，其余各組均注入50μl 80mg/ml的尿酸鹽混懸液，局部消毒預防感染。尿酸鹽注射后分別灌喂相應的藥物，其中黃柏蒼術高劑量組、黃柏蒼術中劑量組、黃柏蒼術低劑量組分別為12、6、3g/kg，秋水仙堿組為0.1mg/kg。正常組、模型組灌喂0.9%氯化鈉溶液。每次灌胃2.5ml，每天1次，連續3天。

6.關節腫脹值：分別用游標卡尺在6、12、24、48、72h測量6組大鼠注射部位同一部位的直徑。用該部位的直徑代表其關節腫脹值。

7.關節液炎性因子的測定：給藥3天后對大鼠進行頸脫臼處死，收集注射部位關節腔積液。根據各ELSIA試劑盒說明書的方法檢測TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的表達。

8.統計學方法：采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料的比較用χ2檢驗；多樣本均數的比較及均數的兩兩比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.柏蒼術湯對急性痛風性關節炎關節腫脹值影響的比較：關節腔注射尿酸鹽懸液后，除正常組外，其余5組小鼠均在1h內出現關節腫脹值增加的情況，且伴隨有紅、腫、熱，大鼠活動功能受限現象，說明急性痛風性關節炎動物模型造模成功。模型組、黃柏蒼術高劑量組、黃柏蒼術中劑量組、黃柏蒼術低劑量組、秋水仙堿組大鼠的關節腫脹值在6、12、24、48h均高于正常組(P<0.05)；在注射后72h正常組的關節腫脹值與秋水仙堿組、黃柏蒼術湯中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，而模型組、黃柏蒼術高劑量組、黃柏蒼術低劑量組與正常組間比較均大于正常組(P<0.05)，同時黃柏蒼術高劑量組和黃柏蒼術低劑量組關節腫脹值顯著小于模型組(P<0.05，表1)。

2.黃柏蒼術湯對急性痛風性關節炎關節液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6表達的影響：模型組大鼠關節液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6均顯著高于其余5組(P均<0.05)。其中，黃柏蒼術中劑量組、秋水仙堿組的TNF-α、IL-1β表達水平顯著低于黃柏蒼術高劑量組和黃柏低劑量組(P均<0.05)，與正常組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。IL-8、IL-6的表達水平在黃柏蒼術高劑量組、黃柏蒼術中劑量組、黃柏蒼術低劑量組、秋水仙堿組、正常組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

表1 5組大鼠不同時間點關節腫脹值比較

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與秋水仙堿組比較，ΔP<0.05；與黃柏蒼術湯高劑量組比較，▲P<0.05；與黃柏蒼術湯中劑量組比較，&P<0.05

表2 5組大鼠關節液中炎性因子的表達水平

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與秋水仙堿組比較，ΔP<0.05；與黃柏蒼術湯高劑量組比較，▲P<0.05；與黃柏蒼術湯中劑量組比較，&P<0.05

討 論

急性痛風關節炎是一種由尿酸鹽晶體沉積于組織和器官引起的急性非特異性炎性反應[7]。本研究造模通過在關節腔局部注射尿酸混懸液，人工模擬痛風的急性發作過程，該模型的構造可有效的研究和評價急性痛風性關節炎藥物治療效果，這主要依據既往的痛風動物模型而選擇[8]。尿酸鹽懸液注射到局部關節后首先迅速引起大量單核-吞噬細胞聚集，大量聚集的巨噬細胞逐漸對尿酸鹽進行吞噬[9，10]。同時，單核-吞噬細胞還可以通過合成和分泌炎性細胞因子如IL-1、TNF-α、趨化因子來進一步方法炎性反應和組織損傷。活化模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)從而激活體內的固有免疫。體內的MSU還可以通過激活Toll樣受體及髓樣分化因子88，從而啟動下游的核因子(NF)-κB，進一步促使TNF-α、IL-1β的表達，促進炎癥的級聯損傷[11，12]。研究發現，尿酸鹽可通過激活NALP3炎性體進一步加劇痛風的炎性反應[13～15]。因此機體通過分泌IL-1β誘導急性炎性反應，固有免疫激活后會募集大量的炎性細胞如單核細胞、粒細胞等，通過大量產生趨化因子及TNF-α、IL-8、IL-6等炎性因子進一步加劇痛風急性發作部位的炎性反應和組織損傷[16]。

本研究顯示，在注射后模型組的大鼠關節腫脹值隨著時間的進展呈逐漸減低的趨勢，這與痛風自然緩解的過程一致。模型組關節腫脹值顯著高于黃柏蒼術高劑量組、黃柏蒼術中劑量組、黃柏蒼術湯低劑量組、秋水仙堿組，且在72h黃柏蒼術高劑量組、黃柏蒼術湯低劑量組關節腫脹值低于秋水仙堿組、黃柏蒼術湯中劑量組，該結果說明了黃柏蒼術湯治療有效，且存在一定劑量的關系，因為隨著黃柏蒼術的劑量改變大鼠的關節腫脹組變化并非完全一致，從研究結果顯示中劑量的結果較優，可能是藥物濃度過高或過低在炎性反應某階段會參與炎性因子的產生。

本研究還發現，模型組大鼠關節液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6顯著增高，均高于其余5組，該組的目的主要是起到陽性對照，可見本研究造模成功，組間有可比性。其中，黃柏蒼術中劑量組、秋水仙堿組的TNF-α、IL-1β表達水平顯著低于黃柏蒼術高劑量組和黃柏低劑量組，可能是由于黃柏蒼術湯治療痛風急性關節炎有某一最適劑量，可能秋水仙堿、中劑量湯劑對TNF-α、IL-1β抑制作用更強。IL-8、IL-6的表達水平在黃柏蒼術高劑量組、黃柏蒼術中劑量組、黃柏蒼術低劑量組、秋水仙堿組、正常組間比較差異無統計學意義，可能是由于IL-8、IL-6受到4組試劑的抑制作用相同。具體藥物劑量對不同細胞因子的抑制作用尚不明確，可能與炎性因子在炎癥誘發緩解的觸發環節不同有關，還需進一步實驗研究加以證實[17]。

本研究對大鼠進行不同藥物灌胃暫未發現不良反應，考慮可能是由于研究樣本量較少，也可能是由于未對研究對象進行生化方面的相關檢測，無法確定有無肝臟、腎臟損傷，但是在實驗過程中各組大鼠活力正常。后期可通過加大樣本量觀察有無藥物不良反應。

綜上所述，黃柏蒼術湯可能通過抑制炎性細胞分泌炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6等，緩解急性炎性反應，改善急性痛風性關節炎的關節癥狀。其效果是否與黃柏蒼術湯的劑量有關還需要進一步驗證。