TLR9敲除可減輕阿霉素誘導的心肌損傷

唐 楠 劉方圓 郭 振 馬淑青 樊 迪 楊 振 唐其柱

以阿霉素(doxorubicin，DOX)為代表的蒽環類藥物被廣泛用于乳腺癌、白血病等多種惡性腫瘤的臨床治療，然而，心臟毒性是阿霉素嚴重的、致命的不良反應，也因此限制了該類藥物在腫瘤治療中的應用。阿霉素的心臟毒性不良反應包括心律失常、心肌病、心肌梗死、左心室功能障礙和心力衰竭[1, 2]。阿霉素引起充血性心力衰竭(CHF)的發生率與總劑量有關[3, 4]。一項大規模回顧性分析觀察到阿霉素累積劑量達400mg/m2，心力衰竭的發生率為5%，累積劑量達550mg/m2和700mg/m2時，心力衰竭發生率分別為26%、48%，在累積劑量超過400mg/m2后，年齡較大的患者(>65歲)CHF發生率更高[5]。Cardinale等[6]組織的前瞻性研究發現蒽環類藥物治療后的心臟毒性大多發生在第1年之內，心臟毒性的發生與蒽環類藥物劑量和治療結束時的LVEF有關。近年來大量實驗研究發現阿霉素所致心肌損傷表現為氧化應激的增加和拓撲異構酶的抑制，從而導致細胞內活性氧產生增加、細胞DNA的損傷、細胞內鈣失調、線粒體功能障礙、能量代謝失衡，最終導致心肌細胞凋亡、細胞外基質重塑[7, 8]。盡管大量的實驗研究揭示了阿霉素所致的心臟損傷的機制，但許多抗氧化劑似乎沒有太大的心臟保護作用，傳統的心血管病藥物(如β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑)的保護作用也非常有限[9]。目前尚缺乏對阿霉素所致心臟損傷的監測、預防和治療手段[10]。因此，尋找阿霉素作用的新靶點仍然是一項挑戰。

Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)是在序列和功能上高度保守的蛋白質分子系列，在炎癥、免疫、腫瘤中發揮著重要作用。Toll樣受體9(TLR9)作為一種細胞內的重要模式識別受體，主要在樹突細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞等免疫細胞中表達，包括心肌在內的幾個器官的非免疫細胞中也發現了TLR9的表達[11, 12]。TLR9參與機體固有免疫、發揮抗病毒作用；還可以通過激活 NF-κB以及MAPKs，誘發免疫炎性反應，并參與細胞自噬過程[13]。研究發現，TLR9相關的信號通路在眾多的心血管疾病的病理生理發展機制中具有重要作用，參與心肌細胞的炎性反應，誘導線粒體功能障礙和死亡，進而導致心肌收縮功能障礙[14, 15]。因此本研究推測TLR9可能參與阿霉素所致的心肌損傷的發生、發展過程，并且目前尚缺乏TLR9在阿霉素誘導的心肌損傷中的作用的實驗研究，本研究擬通過體內外實驗探究TLR9對阿霉素性心肌損傷的影響及機制。

材料與方法

1.主要材料:C57B/6J、TLR9-KO小鼠購自北京華富康生物科技有限公司；H9C2細胞購自上海中國科學院細胞庫；ODN2088購買于德國Miltenyi公司；鹽酸阿霉素(DOX)購自北京索萊寶科技有限公司;TUNEL試劑盒購自瑞士Roche 公司；GAPDH、Bax、Bcl-2、C-caspase-3抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

2.實驗分組及模型建立:在體實驗分為WT組、TLR9-KO組、WT+DOX組、TLR9-KO+DOX組；選取8周齡健康雄性C57B/6J、TLR9-KO小鼠(22～26g)，隨機分為4組，WT組、TLR9-KO組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液10ml/kg，分別于0、7、14、21天皮下注射,為對照組；WT+DOX組、TLR9-KO+DOX組小鼠腹腔注射阿霉素10mg/kg，分別于0、7、14、21天皮下注射，為模型組。離體實驗分為PBS組、PBS+ODN2088組、DOX組、DOX+ODN2088組；大鼠來源H9C2細胞培養于10%胎牛血清的DMEM培養基，在 37℃、5%CO2條件下培養，細胞濃度達80%時傳代培養并制備細胞爬片，PBS組為對照組，DOX組加入1μmol/L DOX構建細胞DOX模型，PBS+ODN2088組、DOX+ODN2088組加入0.2μmol/L ODN2088。

3.檢測心肌損傷標志物:造模第3天取小鼠眶靜脈血，離心取上清，檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。

4.檢測心功能及血流動力學指標:造模第28天檢測小鼠心功能，備皮，充分暴露小鼠胸前區，1.5%異氟烷麻醉，使用高頻超聲探測儀測量并記錄左心室厚度、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(IVESD)、舒張末期室間隔厚度(IVSd)和左心室短軸縮短率(FS%)。應用PowerLab數據采集分析系統描記壓力-容積曲線，測量血流動力學指標，等容收縮期左心室內壓力上升的最大速率(dp/tmax)以及等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(dp/dtmin)。隨后解剖小鼠心臟，稱重，并計算心重/脛骨長。將分子生物學檢測用的心臟組織置于液氮，并儲存在-80℃，供后續實驗用；將病理學染色用的心臟組織置于10%KCl溶液中，使心臟停搏于舒張期。

5.病理學染色:將取出的心臟組織用甲醛固定，石蠟包埋后制備組織石蠟切片，進行TUNEL染色，TUNEL染色完畢后于免疫熒光鏡下拍照，以供分析心肌細胞凋亡指數。

6.Western blot法檢測心肌細胞Bax、Bcl-2、C-caspase-3的含量：提取實驗小鼠心臟組織蛋白，進行BCA 定量，制備上樣蛋白，進行10% SDS-PAGE電泳，分離蛋白后轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別與抗Bax、Bcl-2、C-caspase-3、gapdh抗體于 4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶5000) 室溫孵育1h，TBST 洗膜3次，ECL化學發光后成像系統進行圖像采集。

結 果

1.TLR9對阿霉素誘導的急性心肌損傷的影響:在DOX皮下注射后的第3天，檢測血清中的心肌損傷標志物，結果顯示給予DOX刺激后，小鼠的心肌酶明顯高于相應的對照組(P<0.05)，CK-MB和LDH的值幾乎是對照組的2倍，然而，與野生型小鼠比較，TLR9敲除小鼠在DOX刺激后的心肌損傷程度明顯降低(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 TLR9對阿霉素所致小鼠心肌損傷的影響A.CK-MB;B.LDH。*P<0.05

2.TLR9對阿霉素誘導的慢性心肌損傷的影響：給予DOX刺激后的28天，與對照組比較，DOX刺激后的小鼠的短軸縮短率減低(P<0.05)，而敲除TLR9后，心功能得到了改善，短軸縮短率明顯增加(P<0.05)，dP/dtmax、dP/dtmin也高于WT+DOX組，但差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。另外，通過HE染色觀察心肌細胞橫截面積，DOX刺激可減小心肌細胞橫截面積(P<0.05)，TLR9敲除減輕了這一效應，DOX刺激后，TLR9敲除組小鼠心肌細胞橫截面積大于野生型(P<0.05)，詳見圖2。

表1 各組小鼠心功能指標

與WT組比較，*P<0.05；與WT+DOX組比較，#P<0.05

3.TLR9減輕阿霉素誘導的心肌損傷的機制：通過Western blot法實驗，筆者發現，與對照組比較，給予DOX刺激小鼠的BAX、C-caspase-3的蛋白表達量明顯增高(P<0.05)，Bcl-2的表達量明顯降低(P<0.05)， 同樣給予DOX刺激，TLR9敲除鼠的BAX、C-caspase-3的表達量的增加并不明顯(P<0.05)；相反，Bcl-2的表達量卻比野生型小鼠有所增加(P<0.05)，詳見圖2。筆者又通過TUNEL檢測了細胞凋亡的程度，結果顯示，與對照組比較，DOX組小鼠的細胞凋亡明顯增加(P<0.05)，而TLR9敲除可明顯降低DOX所致的心肌細胞凋亡程度(P<0.05)，詳見圖3。

圖2 各組小鼠心肌Bax、Bcl-2、C-caspase-3的表達情況A.蛋白質電泳圖;B.分別為Bax、C-caspase-3、Bcl-2的蛋白定量圖。*P<0.05

圖3 各組小鼠心肌細胞凋亡情況(TUNEL染色,×200)*P<0.05

4.TLR9抑制劑降低阿霉素所致細胞凋亡：DOX刺激后，相比于對照組H9C2細胞的凋亡顯著增加(P<0.05)，而在給予TLR9抑制劑ODN2088之后，H9C2細胞凋亡程度比DOX組明顯減輕(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 各組H9C2的凋亡情況(TUNEL染色,×200)*P<0.05

討 論

阿霉素作為一種臨床上廣泛使用的化療藥物，其發揮抗癌作用主要是通過插入細胞DNA，干擾拓撲異構酶Ⅱ-DNA裂解復合物，阻礙 DNA的重新連接和雙鏈切割修復，從而阻斷細胞DNA的復制和轉錄，殺死癌細胞。阿霉素的這種作用直接導致細胞DNA損傷、活性氧的產生以及細胞凋亡[9, 16]。也因此不可避免地帶來一系列抗癌不良反應，其中，心臟毒性便是最為突出和致命的一種，也因而限制了其在腫瘤患者中的應用，降低了腫瘤患者的預后。

本研究發現，DOX刺激早期小鼠血清心肌損傷標志物明顯升高，表明DOX可導致心肌細胞的急性損傷，而且在DOX誘導心肌損傷的慢性模型中，筆者發現小鼠心功能受到損傷，短軸縮短率明顯下降，心肌細胞橫截面積相比于對照組也明顯縮小，檢測的凋亡相關指標也明顯升高，而Bcl-2卻明顯減低，表明DOX導致心肌細胞萎縮，凋亡增加，TUNEL染色也證實了這一點。然而當敲除TLR9后，DOX所致的急性心肌損傷得到緩解，LDH、CK-MB相比于野生型小鼠明顯降低，此外，在慢性心肌損傷模型中，敲除TLR9后，小鼠的心功能也明顯得到改善，短軸縮短率顯著升高，此外TLR9敲除鼠的心肌細胞橫截面積也有所增加。相比于野生型小鼠，BAX、C-caspase-3的蛋白表達量在TLR9敲除鼠也明顯降低，而保護細胞免于凋亡的Bcl-2蛋白表達較對照組上調，TUNEL染色也支持TLR9減輕DOX所致心肌細胞凋亡這一結論。通過離體細胞實驗，筆者發現當抑制了TLR9的作用后，DOX誘導的細胞凋亡也受到抑制。因此，TLR9敲除可能通過抑制細胞凋亡減輕DOX所致心肌損傷。

TLR9作為Toll樣受體家族的一員，大量研究證實了其在炎性反應中發揮舉足輕重的作用。在壓力負荷誘導的小鼠心力衰竭模型中發現，敲除TLR9減輕了心肌組織的炎癥和心臟功能障礙[15]。持續的激活TLR9，會增加心肌組織和全身的炎性反應，并且使SERCA2a特異性敲除的舒張期心力衰竭的心臟功能更加惡化[17]。在急性心肌梗死模型中發現mtDNA可以通過激活TLR9，從而激活NF-κB，導致心肌細胞出現線粒體功能障礙和死亡[18]。在動脈粥樣硬化小鼠模型，TLR9通過誘導產生多種促炎因子、趨化因子及其受體的迅速表達，進而促進細胞因子的產生，啟動炎性反應，促進動脈粥樣硬化的發生[19]。

在阿霉素所致心肌損傷中，DNA損傷、氧化應激及炎性反應是關鍵環節，因此，推測TLR9敲除可能通過減輕炎性反應、降低氧化應激從而抑制細胞凋亡，發揮保護阿霉素所致心肌損傷的作用。有研究發現在阿霉素誘導的急性炎性反應中，免疫細胞的凋亡起著關鍵作用，而TLR-2/TLR-9-MyD88信號通路在啟動對凋亡這種免疫原性形式的炎性反應中起核心作用[20]。此外，TLR9也能被從自噬中逃逸的受損線粒體DNA激活，引發心肌細胞炎性發應，并引發心肌炎和擴張型心肌病[21]。因此推測在阿霉素介導的心臟損傷中也可能發生類似的機制，但仍然需要更完善的實驗進一步探究TLR9在阿霉素所致心肌損傷中的作用機制。

綜上所述，本研究發現TLR9敲除可以改善DOX小鼠的心功能，通過抑制凋亡減輕阿霉素所致心肌損傷，這可能為臨床預防及治療阿霉素性心肌損傷提供新的方向，但其具體作用機制仍有待于開展深入的實驗探討。