KISS-1/GPR54在不同生長期大鼠睪丸中的表達分析

馮俊鵬 ， 徐 瑞，2 ， 唐玉玲 ， 嚴 翊

(1.北京體育大學運動人體科學學院 ， 北京 海淀 100084 ； 2.南京體育學院運動健康學院 ， 江蘇 南京 210014 ； 3.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

KISS-1/GPR54被認為是青春期啟動的“開關”，其中KISS-1調節生殖軸并作為青春期開始的分子開關[1]。隨著動物進入青春期，生殖激素開始發揮作用。下丘腦促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)可刺激垂體前葉分泌的促性腺激素(Gonadotropins,Gn)、黃體生成激素(Luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)增加。促性腺激素通過血液循環系統刺激、調節性腺的發育和功能。近幾年來，KISS-1已被鑒定為下丘腦-垂體-性腺軸的上調基因，KISS-1在哺乳動物繁殖中的作用得到了廣泛的研究。KISS-1主要由下丘腦神經元分泌，并通過刺激GnRH神經元上的同源受體GPR54起作用，然后激活調節青春期開始和生殖功能的下游基因。多年來關于KISS-1/GPR54研究的主要熱點都在HPG軸上游的定位和功能，目前已經明確KISS-1/GPR54在多種組織中表達，特別是在胰腺和性腺中表達水平較高。

相關研究已經在人類[2]、小鼠[3]、大鼠[4]和青蛙的睪丸中檢測到GPR54的表達，進一步增加了KISS-1也可以在睪丸發育中起作用的可能性。同時，KISS-1已被發現能在小鼠睪丸間質細胞內表達[5]。對于在人類精子中檢測出的KISS-1和GPR54，主要的部位局限于精子的頭部、頸部和鞭毛的中段[2]。然而，不同的研究對于KISS-1/GPR54在睪丸中的表達定位暫無一致結論，故暫無法推測KISS-1/GPR54在睪丸發育中的功能。由于在生長期過程中，大鼠睪丸結構和功能迅速成熟，故動態研究生長期過程中大鼠睪丸中KISS-1/GPR54表達的變化情況對于進一步探究KISS-1/GPR54在睪丸發育中的生理功能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級3周齡(第21天)離乳大鼠，共60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證編號：SCXK京2012-0001)。經北京體育大學動物福利倫理委員會批準(批準號：2016021A)，動物分籠飼養，室溫20～24 ℃，相對濕度40%～60%，每日12 h光照/12 h熄燈，大鼠自由飲水、飲食。飼料采用高脂對照飼料，購自美國Research Diets公司(貨號：D12451B)。

1.2 取樣 根據前期試驗結果和相關文獻，確定第21天、第35天、第43天、第56天為4個取材時間點。大鼠稱重后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為0.025 mL/(kg·bw)。待麻醉后，腹主動脈取血，分別取兩側睪丸，剝離睪周脂肪及附睪后稱重，并將一側睪丸置于4%多聚甲醛中固定待用；另一側睪丸于冰上剪碎，迅速用編好號的錫箔紙分包成2份，置于液氮中，后轉移至-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3 主要試劑 KISS-1抗體(免疫組化用KISS-1 抗體，MABC60，Millipore產品)；GPR54抗體(免疫組化用GPR54 抗體，GTX37417，GeneTex產品)；KISS-1抗體(WB用KISS-1抗體，ab19028，Abcam產品)；GPR54抗體(WB用GPR54抗體，bs-2501R，Bioss產品)；二抗(Goat Anti-Rabbit IgG H&L，ab6721，Abcam產品)；內參(GAPDH 抗體，ab8245，Abcam產品)。

1.4 免疫組化確定KISS-1/GPR54定位 制備睪丸組織石蠟切片后，石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，下行至蒸餾水，進行抗原修復，羊血清工作液封閉后，滴加已稀釋好的一抗(KISS-1抗體稀釋比1∶500，GPR54抗體稀釋比1∶100)，4 ℃過夜，然后采用通用型二步法反應，滴加DAB顯色液，室溫避光作用2～10 min，經0.1 mol/L pH 7.4 的PBS藍化作用15 min，經梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照(Olympus BX43)。

1.5 實時熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)測定KISS-1/GPR54基因表達 通過Primer-BLAST檢索出相應基因的引物序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按說明書步驟提取總RNA、合成cDNA，進行RT-qPCR試驗。

1.6 Western Blot測定KISS-1/GPR54蛋白表達 按說明書步驟進行總蛋白提取和Western Blot樣品制備。將樣品置于15孔預制膠中，連接電泳儀，將電壓調至140 V，時間為130 min，待Marker條帶分層至10 kDa分子量標記顯現時停止電泳。轉膜后一抗封閉，在4 ℃下搖床過夜；第2天，二抗封閉，在4 ℃下搖床封閉1 h。TBST清洗后，進行曝光，曝光液分A、B液，按1∶1比例現用現配，準備高敏、超敏2種發光液，分別進行曝光，結果以圖片形式進行保存。用成像系統(ChemiDocTM XRS+System,Bio-Rad)讀取條帶灰度值，以GAPDH作為內參，使用Image Lab進行相對定量分析。

1.7 統計方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，數據采用平均值±標準差(Mean±SD)表示。所有數據在進行分析前經正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合標準后，采用重復測量方差分析對結果進行統計分析，取P<0.05 為具有統計學意義顯著差異，P<0.01為具有統計學意義極顯著差異。

2 結果

2.1 生長期大鼠體重、睪重、睪丸指數變化情況 在第21天、第35天、第43天、第56天4個時間點進行動態取材，各時間點大鼠體重、睪重、睪丸指數變化見表1。如表1所示，大鼠體重、睪重、睪丸指數在第21天至第35天階段均出現明顯增加(P<0.01)，其中體重、睪重均隨鼠齡增加而增加(P<0.05)。對于體重，大鼠的體重發育具有一定的階段性，本試驗結果可以發現，雄性大鼠在第21天至第35天處于第1個生長高峰，第35天至第43天大鼠體重增加速度放緩，第21天至第35天體重增長速度最快。大鼠的睪丸重量及睪丸指數可以體現大鼠的睪丸發育水平，本試驗結果可以發現，隨著鼠齡的增加，大鼠的睪丸重量不斷增加，第21天至第35天是大鼠睪丸重量增長最快的階段，后逐漸放緩。大鼠睪重的變化趨勢與體重基本一致。而大鼠的睪丸指數并不一直增加，在經過第21天至第35天的明顯增加后基本穩定。

表1 生長期大鼠體重、睪重、睪丸指數變化情況Table 1 Changes of body weight,testis weight and testis index of growth period rats

2.2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54蛋白表達定位情況 KISS-1/GPR54在生長期各階段大鼠睪丸的生精細胞和間質細胞均見表達，見中插彩版圖1。

2.3 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA表達情況 生長期各取樣點大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA表達情況如表2所示。對于KISS-1 mRNA表達情況，可以看出在第35天處明顯升高出現表達峰值(P<0.01)，隨后雖略有下降但第43天和第56天較第35天均無顯著性差異(P>0.05)。對于GPR54 mRNA表達情況，可以看出第21天至第35天 表達情況幾乎沒有變化，第35天至第43天表達上升(P<0.01)并在第43天出現峰值，隨后雖然在第43天至第56天出現下降，但第56天較第43天表達量無顯著性差異(P>0.05)。

表2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR 54 mRNA表達情況Table 2 KISS-1/GPR 54 mRNA expression in the testis of growth period rats

2.4 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達情況 生長期各取樣點大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達情況如表3所示。隨著鼠齡的增加，大鼠睪丸中KISS-1蛋白表達逐漸增高且各時間點較前一時間點均有顯著性差異(P<0.05)，特別是在第21天至第35天和第43天至第56天2個階段出現非常顯著性差異(P<0.01)。隨著鼠齡的增加，大鼠睪丸GPR54表達也逐漸增加，第21天至第35天階段無明顯變化，第35天至第43天階段蛋白表達極明顯升高(P<0.01)，第43天至第56天階段基本不變。

表3 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達情況Table 3 KISS-1/GPR54 protein expression in the testis of growth period rats

3 討論

3.1 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達定位 對于不同種動物的睪丸中KISS-1/GPR54表達的定位問題研究結果不一，在對五指山豬[6]和黃牛[7]的研究中發現，在睪丸間質細胞、各階段的生精細胞中均發現KISS-1的表達，也有研究發現雄性大鼠睪丸的生精細胞中有KISS-1的表達，但在間質細胞中無表達。相關研究結果不一致影響進一步探究KISS-1/GPR54在睪丸中的生理功能。本試驗通過對于生長期大鼠睪丸進行動態取點研究發現，從第21天開始KISS-1/GPR54在大鼠的間質細胞和生精細胞中均見表達，且隨著青春期發育，在生精細胞的表達量增加。

許孟杰[8]對ICR小鼠的KISS-1/GPR54的蛋白表達定位進行了研究，發現針對ICR小鼠KISS-1僅分布于間質細胞，GPR54在精子細胞中特異性表達，而不是精原細胞、精母細胞或支持細胞。鑒于睪丸存在的“血睪屏障”結構，睪丸間質細胞所分泌的KISS-1無法與精子細胞中表達的GPR54結合產生作用，推測睪丸間質細胞所分泌的KISS-1另有功能。Anjum等[9]從出生到衰老各階段小鼠睪丸中KISS-1的表達定位進行研究，發現在出生時在精原細胞中發現KISS-1，隨著生長發育精原細胞中KISS-1免疫染色后顏色加深，睪丸間質細胞中顏色變淺，到青春期期間睪丸間質細胞中顏色變深，進入衰老期KISS-1主要集中在睪丸間質細胞表達。其他對于小鼠的研究也發現不同鼠齡特別是處于生殖周期的不同階段，KISS-1/GPR54表達定位結果不同。據此可以推斷，KISS-1/GPR54可能參與大鼠精子成熟和性激素分泌，但在生殖周期的不同階段KISS-1/GPR54在大鼠睪丸中的生理功能可能有所不同。

3.2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA和蛋白的表達情況 本試驗采用動態取點的方法，取離乳期(第21天)、青春期前期(第35天)、青春期(第43天)、青春期后期(第56天)4個時間點進行研究發現，KISS-1/GPR54 mRNA在大鼠睪丸中均有表達，且呈現一定的時序性變化趨勢。就KISS-1 mRNA表達情況來看，從第21天至第35天這個時間段，大鼠睪丸中KISS-1 mRNA表達明顯增高，在第35天出現峰值，隨后略有降低但無顯著性差異。就GPR54 mRNA表達情況而言，第21天至第35天這個時間段GPR54表達基本穩定，第35天至第43天時間段出現顯著性增加，第43天至第56天表達出現下降但無顯著性差異。對比可以發現，GPR54表達峰值的出現晚于KISS-1表達峰值。可能由于KISS-1對于能量變化更為敏感有關，且GPR54為KISS-1的受體，當KISS-1表達增高并積累到一定程度時GPR54表達才出現增高。KISS-1/GPR54 蛋白在大鼠睪丸中均有表達，與mRNA的表達結果一致，但也表現出一定的時序性特點。就KISS-1蛋白表達情況來看，隨著鼠齡的增加，KISS-1蛋白表達逐漸增加，在第43天至第56天表達增加更加明顯，在第56天出現峰值。就GPR54蛋白表達情況來看，第21天至第35天GPR54蛋白表達基本保持不變，在第35天至第43天出現明顯的增加，第43天至第56天基本保持不變，在第56天出現峰值。綜上，KISS-1/GPR54在睪丸中表達蛋白峰值出現的時間點晚于mRNA峰值出現的時間點，且KISS-1峰值出現早于GPR54峰值的出現。

許孟杰[8]用細胞分離的方法研究發現，KISS-1 mRNA主要表達于睪丸間質細胞，GPR54 mRNA主要表達于生精小管細胞，而非睪丸間質細胞。曾泰祥[10]發現，對于12周齡的ICR小鼠KISS-1與GPR54都高度表達于睪丸的睪丸間質細胞中，由此推測，KISS-1可能分泌自睪丸間質細胞并作用于睪丸間質細胞本身而形成自分泌(Autocrine)路徑。此外，同樣的試驗對于4周齡未進入青春期的ICR小鼠，發現未進入青春期的ICR小鼠睪丸間質細胞的KISS-1和GPR54表達量顯著低于青春期后的小鼠。根據上述試驗結果，雖然KISS-1可能通過自分泌途徑直接作用于睪丸，但是KISS-1/GPR54系統在生殖功能調節中的確切生理作用仍有待闡明。

4 小結

本試驗表明，KISS-1/GPR54在生長期大鼠睪丸生精細胞和間質細胞均表達。大鼠睪丸中KISS-1/GPR54表達呈現一定的時序性，mRNA和蛋白表達趨勢基本一致，第21天至第56天整體上均呈現一定的表達上升的趨勢。據此推測在生殖周期的不同階段，大鼠睪丸中KISS-1/GPR54的生理功能可能有所不同。