全反式維甲酸增強肺炎鏈球菌對小鼠的致病性

牛小飛 ， 王宏艷 ， 連朋敬 ， 白 玉 ， 李靜云 ， 張子卉 ， 楊俊琦 ， 趙立紅 ， 喬 健

(1. 中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 河北工程大學生命科學與食品工程學院 ， 河北 邯鄲 056038)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)是一種定植于人體鼻咽部的革蘭陽性球菌，屬于條件性致病菌，可引起肺炎、腦膜炎、菌血癥等多種疾病[1]。肺炎鏈球菌性疾病是全球嚴重的公共衛生問題之一，也是導致兒童、老年人及免疫缺陷群體發病和死亡的重要原因，全球每年約200萬人死于S.pn感染[2]。全反式維甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)是維生素A的天然代謝產物，其作為營養補充劑和免疫調節劑在臨床上應用十分廣泛，是孕婦和兒童補充維生素A，以及治療兒童麻疹、痤瘡、夜盲癥、急性早幼粒細胞白血病等的一線用藥[3-7]。因此，由于抵抗力下降而誘發S.pn感染的人群與龐大的ATRA使用人群必然會發生重疊。另外，研究表明，ATRA能夠通過核受體信號通路調控肺上皮細胞的生長、分化和基因表達及肺部的免疫反應[8]，而肺又是S.pn最主要的靶器官，因此，當ATRA使用人群同時發生S.pn感染時，ATRA的應用是否會影響肺部的免疫反應，從而影響S.pn對機體的致病性是一個亟待解決的科學問題，但目前尚無相關報道。為此，本研究評估了使用不同劑量的ATRA對S.pn致病性的影響，為臨床上應用ATRA 的人群在感染S.pn后的風險評估提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 THB培養基、酵母浸粉，均購自青島海博生物技術有限公司；ATRA、棉籽油，均購自Sigma公司；異氟烷，購自河北一品制藥股份有限公司。

1.2 主要儀器 電子天平(YP40001)，上海越平科學儀器有限公司產品；生物安全柜(BSC-1100 II A2)，北京東聯哈爾儀器制造有限公司產品；紫外可見分光光度計(T6)，北京普析通用儀器有限責任公司產品。

1.3 試驗動物和細菌 6～8周齡，雄性，SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；S.pn(NCTC7466)，由重慶醫科大學惠贈。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計 將152只BALB/c小鼠隨機分為8組，分別為空白對照組、ATRA1對照組、ATRA2對照組、ATRA3對照組、感染組、ATRA1感染組、ATRA2感染組、ATRA3感染組，每組19只，其中14只用于檢測體重、采食量和存活率，5只用于檢測肺系數和肺組織病變。小鼠腹腔注射棉籽油或ATRA 10 d，第11天鼻腔接種PBS或S.pn。空白對照組，注射棉籽油后接種PBS；ATRA1對照組、ATRA2對照組、ATRA3對照組，分別注射1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA后接種PBS；感染組，注射棉籽油后接種S.pn； ATRA1感染組、ATRA2感染組、ATRA3感染組，分別注射1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA后接種S.pn。

1.4.2 ATRA的配制及使用 稱取一定量ATRA粉末，將其溶于二甲基亞砜(DMSO)，然后加入棉籽油，將其配制成1、5、10 mg/(kg·bw) 注射液，給小鼠腹腔注射0.2 mL/次，1次/d，連續注射10 d。空白對照組注射棉籽油。

1.4.3S.pn的培養及接種劑量的確定 將S.pn接種于THY培養基(THB培養基中加入0.5%酵母浸粉)，37 ℃培養至對數生長中期，4 ℃、5 000 r/min離心10 min后收集沉淀，PBS洗2次，再用PBS制成細菌懸液。將細菌懸液用PBS稀釋成不同濃度后，給小鼠鼻腔接種，根據其臨床癥狀及死亡情況確定接種劑量。本研究中，S.pn的接種劑量為1.6×108CFU/mL，0.1 mL/只，此時小鼠有明顯的臨床癥狀但不會死亡。

1.4.4 體重、采食量、存活率變化的測定 體重、采食量和存活率是反映病原致病性的國際通用指標。本研究將小鼠用異氟烷麻醉后鼻腔接種S.pn，連續6 d記錄體重、采食量和死亡情況，并根據以下公式計算體重變化率、采食量變化率及存活率：體重變化率=當天體重/初始體重×100%；采食量變化率= 當天采食量/初始采食量×100%；存活率=存活數/總數×100%。

1.4.5 肺系數和肺組織病變檢查 肺系數和肺組織病變是反映肺水腫和肺損傷程度的重要指標。在感染后6 h，各組小鼠用過量的異氟烷麻醉使其安樂死，稱量體重后剖檢，取全肺稱重，按以下公式計算肺系數：肺系數=全肺重量(mg)/體重(g)，并將肺組織固定于10%中性福爾馬林緩沖液，經脫水、透明、包埋、切片后進行蘇木素-伊紅(H.E.)染色，顯微鏡下觀察并記錄病理變化。

1.5 統計分析 試驗結果以“平均數±標準誤”方式表示。采用SPSS 20軟件對數據進行統計分析，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)法、存活率用log-rank (Mantel-Cox) test法進行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 ATRA對小鼠感染S.pn后體重的影響 由表1可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA對照組與空白對照組相比，體重無顯著差異(P>0.05)；感染組與空白對照組相比，體重顯著下降(P<0.05)；1 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，體重無顯著差異(P>0.05)；5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，體重均顯著下降(P<0.05)。

表1 ATRA對小鼠感染S. pn后體重的影響Table 1 Effects of ATRA on body weight in mice infected with S. pn

2.2 ATRA對小鼠感染S.pn后采食量的影響 由表2可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA對照組與空白對照組相比，采食量無顯著差異(P>0.05)；感染組與空白對照組相比顯著下降(P<0.05)；1 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比無顯著差異(P>0.05)；5 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，在感染后第6天顯著降低(P<0.05)； 10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，在感染后第3、6天顯著降低(P<0.05)。

表2 ATRA對小鼠感染S. pn后采食量的影響Table 2 Effects of ATRA on food intake in mice infected with S. pn

2.3 ATRA對小鼠感染S.pn后存活率的影響 由表3可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA對照組、感染組存活率均為100%，與空白對照組相同；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組存活率分別為100%、85.71%、71.43%，1、5 mg/(kg·bw) ATRA 感染組與感染組相比無顯著差異(P>0.05)；10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比差異顯著(P<0.05)。

表3 ATRA對小鼠感染S. pn后存活率的影響Table 3 Effects of ATRA on survival rate in mice infected with S. pn [% (n1/n),n=14]

2.4 ATRA對小鼠感染S.pn后肺系數的影響 感染后6 h小鼠肺系數變化結果如圖1所示，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA對照組與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)；感染組與空白對照組相比顯著升高(P<0.05)；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比均無顯著差異(P>0.05)。

圖1 ATRA對小鼠感染S. pn后肺系數的影響Fig.1 Effects of ATRA on lung coefficient in mice infected with S. pn

2.5 ATRA對小鼠感染S.pn后肺組織病變的影響感染后6 h小鼠肺組織病變如中插彩版圖2所示，1、5 mg/(kg·bw) ATRA對照組與空白對照組相比無顯著變化，10 mg/(kg·bw) ATRA對照組與空白對照組相比，肺泡膈輕度增厚；感染組與空白對照組相比，肺泡膈輕度增厚，毛細血管輕度充血；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，隨著ATRA劑量增加，肺組織病變程度逐漸增加，表現為肺泡膈增厚及充血程度增加，炎性細胞增多。

3 討論

S.pn是導致人類細菌性肺炎最重要的病原。ATRA是維生素A的活性代謝產物，在臨床上應用非常廣泛。ATRA能夠通過核受體信號通路調控肺上皮細胞的生長、分化和基因表達及肺部的免疫反應[8]。研究表明，缺乏維生素A的孟加拉國新生兒，在補充維生素A后死亡率降低[9]；新生兒患S.pn肺炎后，補充維生素A可抑制成年期哮喘的發展[10]。而對于成年后由于各種原因使用ATRA對機體感染S.pn有無影響未見報道。

本研究發現，應用維甲酸可增強S.pn對小鼠的致病性，且隨著ATRA劑量的增加，S.pn對小鼠的致病性逐漸增強。具體表現為：與感染組相比，5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組的體重、采食量和存活率均降低；肺系數升高；肺組織病變程度增加；且10 mg/(kg·bw) ATRA感染組比5 mg/(kg·bw) ATRA感染組的嚴重程度增加。本研究中，維甲酸在S.pn感染中不但沒有發揮有利的調節作用，反而使S.pn的致病性增強。目前關于ATRA對呼吸道感染的影響的報道中結果并不一致，營養不良或有更嚴重疾病的兒童最有可能從ATRA中獲益[9]。而給亞臨床維生素A缺乏的兒童服用大劑量維生素A后，其急性呼吸道感染的發病率反而增加[11]。另有研究報道，應用高水平的ATRA會導致肺組織的病理損傷，其原因可能是由于ATRA能夠使肺組織致敏[12]。綜上所述，我們推測在本研究中，使用ATRA后能夠增強S.pn對機體的致病性，其原因有可能是連續給予小鼠ATRA后，機體肺組織處于致敏狀態，引起肺組織損傷，從而對S.pn的抵抗力降低所致。本研究提示，臨床上應用維甲酸的人群在感染S.pn后風險增加，本研究對公共衛生具有重要的指導價值。