不同年代雞源沙門菌的流行性及耐藥性研究

張 璐 ， 張純萍 ， 李偉杰 ， 趙 琪 ， 徐錦濤

(1. 中國獸醫藥品監察所 ， 北京 海淀 100081 ； 2. 青島初心動物醫院管理有限公司 ， 山東 青島 266109)

沙門菌(Salmonella)屬腸桿菌科中的人獸共患病原菌，其宿主廣泛，既可以水平傳播又可以垂直傳播，對畜禽產業和人類食品的安全危害嚴重[1]。被沙門菌污染的雞肉制品是人感染沙門菌最主要的來源之一。沙門菌血清型種類眾多，不同血清型對家禽和人類所引起的臨床癥狀及造成的危害程度也不同[2]。雞感染沙門菌后可引起雞白痢、禽傷寒和輸卵管感染等疾病，人感染后會導致傷寒樣發熱、惡心、嘔吐、腹部絞痛和腹瀉等感染性疾病。

目前我國已經發現300多種血清型[3]。研究表明，我國的雞源沙門菌血清型以雞白痢、腸炎、鼠傷寒為主[4]，但不同年代的優勢血清型差異較大[5]。研究血清型的變化對了解沙門菌流行情況和監測公共衛生數據具有重要意義。隨著抗菌藥物在家禽中的預防性和治療性的應用，雞源沙門菌的耐藥性也越來越嚴重[6]。鑒于此，文章對1970—2015年雞源沙門菌進行了血清分型和藥敏試驗，旨在比較不同年代沙門菌的流行趨勢和對抗菌藥物的耐藥性變化，為家禽沙門菌的防控和公共衛生安全提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 共收集到菌株412株，其中1970—1980年菌株(38株)、1981—2000年菌株(12株)為獸醫微生物菌種保藏管理中心保存，2001—2010年菌株(169株)為中國獸醫藥品監察所動物源細菌耐藥監測實驗室保存，2011—2015年菌株(193株)為中國獸醫藥品監察所動物源細菌耐藥監測實驗室和獸醫微生物菌種保藏管理中心保存。血清型鑒定的陽性菌株來自中國獸醫藥品監察所安全評價室已鑒定出的沙門菌。藥敏試驗的質控菌株大腸桿菌ATCC25922和ATCC35218，均購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 培養基、材料 SWARM半固體瓊脂，購自北京陸橋技術有限責任公司；普通營養瓊脂、沙門菌顯色培養基，均購自青島海博生物有限公司；沙門菌分型(180種)血清，購自丹麥血清研究所；革蘭陰性需氧菌藥敏板、藥敏接種培養液、5 mL生理鹽水，均購自上海星佰生物技術有限公司；DNA marker DL-2 000，購自寶生物工程(大連)有限公司；2× GoTaqGreen Master Mix試劑，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 菌株鑒定 菌株通過營養瓊脂進行復蘇，復蘇后提取單菌落接種于沙門菌顯色培養基上，(36±1) ℃培養24 h，典型的沙門菌在沙門菌顯色培養基上呈紫色。對初步純化后為沙門菌的菌株通過 PCR 檢測沙門菌持家基因invA。根據是否檢出invA基因來鑒定沙門菌[7]。PCR反應體系為25 μL：2×Mix 12.5 μL；上下游引物(50 μmol/L)各0.25 μL；模板2 μL； 加ddH2O 10 μL補足25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；最后72 ℃延伸10 min。1.2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，必要時進行測序判定是否為沙門菌。

1.4 血清型鑒定 用無菌槍頭挑取營養瓊脂上的菌落與菌體(O)抗原多價血清充分混勻，30 s內觀看凝集反應，若凝集則說明具有對應的O抗原，鞭毛(H)抗原的檢測需要在SWARM半固體瓊脂上培養，并以已知沙門菌的菌株為陽性對照，生理鹽水為陰性對照，即檢驗菌株在生理鹽水中無自凝現象。根據O抗原和H抗原的檢測結果對照沙門菌屬抗原表[8]確定血清型。

1.5 藥敏試驗 試驗選擇臨床常用的具有代表性的12種抗菌藥物進行藥敏試驗，并根據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)標準[9]，采用微量肉湯稀釋法對不同年代沙門菌進行耐藥性特征分析：挑取2～3個單菌落置5 mL滅菌生理鹽水中，用0.5麥氏比濁管進行比濁，調制菌液濃度為1×108～2×108CFU/mL；取菌液60 μL加入12 mL的藥敏接種培養液中，進行混勻稀釋，利用微生物自動加樣儀加入96孔革蘭陰性需氧菌藥敏板中，每孔100 μL，陰性對照孔單獨加入100 μL藥敏接種培養液，37 ℃ 恒溫培養箱培養18～20 h。在陰性對照孔清澈，陽性對照孔渾濁以及質控菌株的最低抑菌濃度符合規定范圍的前提下，根據CLSI藥敏判定標準[9]進行被檢菌株的敏感性：敏感(S)、中度敏感(I)或耐藥(R)，未有菌生長的最低濃度即為該菌株對此抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)值，若所有濃度下均見菌生長，則該菌株對此抗菌藥物的MIC值為大于其最高稀釋濃度。

2 結果

2.1 沙門菌的鑒定 412株菌株通過沙門菌顯色培養基和PCR方法共純化鑒定出雞源沙門菌共328株，其中1970—1980年38株，1981—2000年12株，2001—2010年143株，2011—2015年135株。

2.2 血清型鑒定 對不同年代的328株沙門菌進行血清分型，其中255株為可分型沙門菌，22株為Ⅱ型菌株并有51株未鑒定出血清型。由表1所示，255株沙門菌共分為10種不同的血清型，雞源沙門菌在1970—2000年的優勢血清型為雞白痢，2000年以后腸炎沙門菌為主要血清型，其次為雞白痢，并且出現山夫登堡等多種的血清型。

表1 不同年代沙門菌的血清型分布Table 1 Serotypes distribution of Salmonella in different ages

2.3 MIC檢測 試驗對不同時期的沙門菌進行了12種抗菌藥物的耐藥性檢測，所有菌株對阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、美羅培南、阿奇霉素、恩諾沙星敏感，對其他7種抗菌藥物耐藥性結果如表2所示。1970—2000年分離的雞白痢沙門菌僅對頭孢噻呋、黏菌素、磺胺異噁唑出現低水平的耐藥，2001—2010年分離的雞白痢沙門菌對黏菌素、磺胺異噁唑的耐藥率升高，并對氨芐西林、四環素、復方新諾明、氟苯尼考出現耐藥，但對頭孢噻呋的耐藥率為0。2011—2015年分離的雞白痢沙門菌對氨芐西林、四環素、氟苯尼考、磺胺異噁唑的耐藥率有所下降。從2001—2010年開始，腸炎沙門菌對氨芐西林、四環素、黏菌素、復方新諾明、磺胺異噁唑出現耐藥，2011—2015年腸炎沙門菌對氨芐西林、磺胺異噁唑耐藥率大幅度上升。雞白痢沙門菌的總體耐藥水平以及多重耐藥率明顯高于腸炎沙門菌。

表2 不同年代沙門菌對不同抗菌藥物耐藥率Table 2 The resistance rate of Salmonella to different antimicrobial agents in different ages (%)

3 討論

試驗菌株來源廣泛，所用的血清型為系統的丹麥血清型，分型結果準確。從1970—2015年分離的雞源沙門菌主要血清型為雞白痢和腸炎。雞白痢沙門菌從20世紀70年代到2015年間一直是貫穿我國家禽養殖業的重要血清型之一。這一結果與王建舫等[10]在2009年對禽源沙門菌研究的血清型以及施開創等[11]在2015年對雞源沙門菌研究的血清型結果一致。雞白痢是導致家禽高發病率和高死亡率的主要血清型，加強對雞白痢的凈化工作尤為重要。

腸炎沙門菌在2000年以后大量出現，并逐漸成為沙門菌的優勢血清型之一。張秀英等[12]2007年鑒定的雞源沙門菌血清型主要為腸炎。趙建梅等[13]2008—2017年鑒定的雞源沙門菌血清型主要為腸炎。其比例的增多可能與雞場雞白痢的凈化有關，其次，腸炎沙門菌感染成年禽的死亡率較低，臨床癥狀不明顯，可長期定植于腸道和生殖道中并長期排菌傳播，導致腸炎沙門菌菌株不斷增多[14]。近幾年，腸炎沙門菌的比例也明顯超過了雞白痢[4,15]。自2000年后試驗鑒定出了山夫登堡、哈達爾等多種血清型，這可能是由于進出口貿易的增長，國內外沙門菌的交叉感染以及抗原的變異導致血清型的種類逐漸增多。

本試驗發現，雞白痢在20世紀70—80年代的耐藥率較低，在2000—2010年對氨芐西林、四環素、氟苯尼考、黏菌素、磺胺異噁唑的耐藥率急劇升高，但在2011—2015年有所下降。我國從20世紀60年代開始就有研究發現，雞白痢沙門菌對磺胺類藥物、四環素、慶大霉素等藥物的耐藥性呈現出顯著增強的趨勢[16]。代娟娟等[17]研究2002—2007年雞白痢對四環素的耐藥率逐漸增強，且對磺胺類藥物一直具有很高的耐藥率，與本試驗結果一致。沈欣悅等[18]研究2013—2017年雞白痢對四環素的耐藥率呈下降趨勢，與本試驗中四環素的耐藥趨勢一致。

腸炎沙門菌隨時間的變化對氨芐西林、四環素、復方新諾明、磺胺異噁唑的耐藥率逐漸增強。崔苗苗[19]等研究的2017年腸炎沙門菌對氨芐西林、磺胺異噁唑等耐藥性較強，而對頭孢噻呋、恩諾沙星等藥物的耐藥性較弱與試驗中腸炎沙門菌的耐藥結果一致。本試驗在2011—2015年間雞白痢對復方新諾明和氟苯尼考的耐藥率為0，腸炎沙門菌對黏菌素的耐藥率也為0，這可能與菌株來源以及抗菌藥物的使用情況有關。也有相似研究結果表明，2014年江蘇地區雞白痢對氟苯尼考的耐藥率為0，山東地區腸炎沙門菌對多黏菌素敏感[20-21]。

根據雞白痢和腸炎沙門菌對不同抗菌藥物的耐藥率分析，不同時期不同血清型對抗菌藥物的耐藥性差異較大。2001—2010年分離的沙門菌中，雞白痢對氨芐西林、磺胺異噁唑、四環素的耐藥率明顯高于腸炎，且多重耐藥情況也較為嚴重。研究發現，這可能與不同血清型的耐受程度有關[22]。