4種肉類成分多重PCR的鑒定方法

袁淑輝 ， 蔡 軍 ， 王忠才 ， 李 舟 ， 王建昌 ， 王素華

(1.溫州海關綜合技術服務中心 ， 浙江溫州325027 ； 2. 石家莊海關技術中心 ， 河北石家莊050051)

肉類食品安全是世界范圍內面臨的共同問題，2014年歐洲暴發的“馬肉風波”揭露了多國肉制品的摻假現象。不法商家在利益驅使下，在肉制品生產和消費過程中，利用以假亂真、以次充好等手段欺騙消費者而牟取暴利的事件屢屢出現，嚴重擾亂了市場秩序，侵害了生產者和消費者的合法利益，并涉及少數民族的宗教信仰，同時帶來了嚴重的食品安全隱患。傳統的肉種類鑒定主要依靠感官和經驗，通過辨別肉制品的味道和色澤，在顯微鏡下觀察肉的紋理等方法對肉類進行鑒別。但是傳統的鑒別方法只適用于生鮮肉類，且需要豐富的經驗，鑒別過程極具主觀性，已無法滿足對肉制品摻假現象進行控制與監管的需要[1]。因此，對于居民消費量大、肉制品市場占有率較高的牛肉、豬肉、雞肉以及曾被摻假使用的馬肉，建立準確、快速、高通量的鑒定方法已十分必要[2]。

以基因組DNA為研究對象的PCR擴增技術已經成為肉類種屬鑒定的核心方法[3-5]。許多國內外學者根據不同物種的基因序列設計特異性引物，利用PCR反應實現特異性基因片段的指數級擴增，通過凝膠電泳條帶或熒光曲線鑒別食品中可能的物種來源[6-8]。本試驗基于牛、豬、雞和馬線粒體細胞色素b基因設計了1條通用正向引物F ； 以牛、豬、雞和馬的特定DNA序列為研究對象，設計了4條特異性反向引物，建立了牛、豬、雞和馬4種肉類成分通用引物的多重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料 以市售合格的牛、豬、雞、馬、羊、鴨、鴿、鵪鶉以及兔肉為試驗材料，各物種肉樣分別攪碎后-20 ℃ 保存，避免交叉污染。

1.2 主要試劑 Quick-DNATM提取和純化試劑盒，購自Zymo Research公司；TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTPs(10.0 mmol/L)、MgCl2(25 mmol/L)、DL-5 000 DNA Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 用Quick-DNATM提取和純化試劑盒提取1.1中的肉類總DNA，總DNA樣品溶于TE緩沖液中，于-20 ℃保存備用。

1.3.2 引物設計與合成 依照Matsunaga等[9]推薦的方法設計牛、豬、雞和馬線粒體細胞色素b基因的特異性引物，根據牛、豬、雞和馬線粒體細胞色素b基因序列設計正向通用引物CF；根據牛、豬、雞、馬的種屬特異性DNA序列設計專屬的反向引物。引物擴增長度和序列見表1。引物由上海華大基因科技有限公司合成。

表1 引物序列及擴增片段長度Table 1 Primer sequence and amplification length

1.3.3 多重PCR的反應條件及優化 在50 μL多重PCR反應體系中分別進行牛肉、豬肉、雞肉和馬肉4種肉類的鑒別。反應體系：10×PCR Buffer 5.0 μL， dNTPs(10.0 mmol/L)1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，CF、牛-R、豬-R、雞-R、馬-R(10 mmol/L)各1.0 μL，稀釋至10 ng/μL的DNA模板2.0 μL，加滅菌去離子水至50.0 μL。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃結束反應。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.3.4 特異性試驗 按照1.3.3中的反應體系及優化的反應條件，分別使用牛肉、豬肉、雞肉和馬肉4種肉類DNA及兩兩等比例混合DNA和羊肉、鴨肉、鴿肉、鵪鶉肉和兔肉的DNA對引物的檢測特異性進行驗證。

1.3.5 敏感性試驗 將濃度為10 ng/μL的4種目標肉類DNA 10倍梯度稀釋，使用1.3.3的反應體系及優化的反應條件，分別針對牛肉、豬肉、雞肉和馬肉4種肉類驗證多重PCR方法的靈敏度。

1.3.6 多重PCR方法檢測混合樣品 應用1.3.3中建立的方法對混合肉樣進行PCR擴增，反應時分別加入1種、2種、3種和4種肉樣DNA的混合物，進行多重PCR檢測。

1.3.7 市售樣本的檢測 應用建立的多重PCR檢測方法對市場采購的8類共80個不同的牛肉制品進行鑒定，并與實驗室常用的熒光定量PCR試劑盒鑒定結果進行比較，驗證方法的準確性應用價值，并了解市場上肉類摻假的真實情況。

2 結果

2.1 模板DNA質量 用核酸蛋白分析儀測定提取的基因組DNA的濃度和純度，所測OD260 mm/OD280 mm值在1.8～2.1，濃度為130～180 ng/μL，從樣品中提取的DNA無論是濃度還是純度都較高，能滿足后續PCR擴增試驗的需要。

2.2 多重PCR反應條件優化 通過退火溫度的梯度PCR試驗，結合PCR擴增的特異性與產物量，確定最佳退火溫度為60 ℃。使用1.3.3中的方法擴增的牛肉、豬肉、雞肉和馬肉4種肉類DNA片段長度分別為274 bp，394 bp，221 bp和433 bp，結果見圖1。

圖1 4種肉類PCR產物凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophores is of PCR products of four kinds of meatM: DL-5 000 DNA marker; 1：馬肉； 2：牛肉； 3：豬肉； 4：雞肉M: DL-5 000 DNA marker; 1:Horse; 2:Beef; 3:Pork; 4: Chicken

2.3 引物特異性驗證 分別使用4種目標肉類的單一種類DNA和兩兩等比例混合DNA及羊肉、鴨肉、鴿肉、鵪鶉肉和兔肉的DNA對引物的檢測特異性進行驗證與比較，結果見圖2。對牛肉、豬肉、雞肉和馬肉4種肉類的單一種類和兩兩混合DNA進行檢測，均能在設計位置觀察到特異性條帶，未見非特異性擴增，且與羊肉、鴨肉、鴿肉、鵪鶉肉和兔肉的DNA均無交叉反應。

圖2 多重PCR特異性試驗Fig.2 Specificity results of multiplex PCRM: DL-5 000 DNA marker; 1：馬肉； 2：牛肉； 3：豬肉； 4：雞肉； 5：馬肉和牛肉； 6：馬肉和豬肉； 7：馬肉和雞肉； 8：牛肉和豬肉； 9：牛肉和雞肉； 10：豬肉和雞肉； 11：羊肉； 12：馬肉、牛肉和雞肉；13：馬肉、豬肉和雞肉； 14：鵪鶉肉； 15：兔肉M: DL-5 000 DNA marker; 1：Horse； 2：Beef； 3：Pork； 4：Chicken；5：Horse and beef； 6：Horse and pork； 7：Horse and chicken； 8：Beef and pork； 9：Beef and chicken； 10：Pork and chicken； 11：Ovine； 12：horse, beef and chicken； 13：horse, pork and chicken； 14：Quail； 15：Rabbit

2.4 敏感性試驗 將10 ng/μL的牛、豬、雞和馬肉DNA模板進行10倍梯度稀釋，使用1.3.3中的反應體系及優化的反應條件，針對上述4種肉類DNA驗證多重PCR方法的靈敏度，結果見圖3。由圖3可見，4種肉類DNA各至稀釋10-3后，使用多重PCR方法進行檢測，仍能觀察到微弱的特異性條帶；目標DNA稀釋至10-4后進行多重PCR擴增，不能觀察到特異性條帶。因此，檢測的靈敏度可達到10×10-3ng/μL。

圖3 多重PCR敏感性試驗Fig.3 Specificity results of multiplex PCRM: DL-5 000 DNA marker; H：馬肉； B：牛肉； P：豬肉； C：雞肉M: DL-5 000 DNA marker; H：Horse； B：Beef； P：Pork； C：Chicken

2.5 混合肉樣檢測 用建立的多重PCR快速檢測方法，分別以牛、豬、雞和馬肉的DNA為模板，按照1.3.3中優化的反應條件進行多重PCR檢測，4種肉類的單一種類DNA、2種、3種及4種DNA等比混合物均能得到有效鑒別，結果見圖4。

圖4 混合肉樣檢測結果Fig.4 Results of mixed meat samplesM: DL-5 000 DNA marker; 1：馬肉； 2：牛肉； 3：豬肉； 4：雞肉； 5：牛肉和雞肉； 6：豬肉和雞肉； 7：馬肉和雞肉； 8：馬肉和牛肉； 9：豬肉和牛肉； 10：馬肉和豬肉； 11：牛肉、豬肉和雞肉； 12：馬肉、牛肉和雞肉； 13：馬肉、豬肉和雞肉；14：馬肉、牛肉和豬肉； 15：馬肉、牛肉、豬肉和雞肉； 16：陰性對照M: DL-5 000 DNA marker; 1：Horse； 2：Beef； 3：Pork； 4：Chicken； 5：Beef and chicken； 6：Pork and chicken； 7：Horse and chicken；8：Horse and beef； 9：Pork and beef； 10：Horse and pork； 11： Pork, beef and chicken； 12：Horse, beef and chicken； 13：Horse, pork and chicken； 14：Horse, pork and beef； 15：Horse, pork, beef and chicken； 16：Negative control

2.6 市售肉制品檢測 應用建立的多重PCR方法對市場采購的8種80個不同牛肉制品進行摻假鑒定，判定與所貼標簽是否相符，同時驗證所建立的多重PCR檢測方法推廣使用的可行性。鑒別結果見表2，由表2可知，部分牛肉產品存在一定的摻假和食品安全問題。混合引物能夠擴增出多種肉類相應的特異性條帶，能準確鑒定出幾種常見的動物源性成分，經過熱加工的肉制品擴增條帶仍然十分清晰。多重PCR與商品化熒光定量PCR檢測試劑盒對80個不同牛肉制品摻假的檢測結果基本吻合，只對一組10個樣品的盒裝牛肉片檢測結果有差異，熒光定量PCR檢測試劑盒比多重PCR的檢出率高10%，這可能是由于摻入量少，多重PCR未能檢出。牛、豬、雞、馬肉等常見肉食品的種類在日常檢測鑒定中占很大比重，此方法可作為政府檢驗部門對肉制品的常規檢測，用于肉類真偽鑒別和摻假成分的判斷。

表2 實際樣品檢測結果Table 2 Results for market samples

3 討論

近年來，隨著分子生物學檢測技術的不斷發展，逐步形成了以核酸檢測為基礎的鑒定體系。在鑒定動物源性成分的過程中，多重PCR技術可通過一次擴增同時檢測多個靶標基因，彌補了普通PCR在肉制品摻假檢測中的不足，成為常見的鑒定方法之一。本試驗在參考前人研究的基礎上[10-11]，基于牛、豬、雞和馬的特定基因，建立了快速檢測4種肉類成分的多重PCR方法。采用正向引物通用、反向引物特異的設計策略，應用包含5條引物的多重PCR體系實現4個物種的鑒定，盡量控制引物數量過多引起的交叉干擾。經引物序列和反應體系優化，建立的多重PCR具有較高的敏感性和特異性。相比于普通PCR和實時熒光定量PCR技術對動物源性成分的鑒定，本試驗具有檢測儀器簡單、檢測成本低、檢測通量高等優點，更適合于對大量肉制品摻假的鑒別篩選。

近年來曝光的肉制品摻假主要是使用售價較低的豬肉、雞肉和馬肉等摻入到售價較高的牛肉和羊肉中。本試驗針對可能出現的摻假肉類種類，篩選出保守性強的在牛、豬、雞、馬物種特異性基因，并驗證了其特異性和敏感性。建立的多重PCR反應體系對于同時鑒定目標肉類中的2種、3種或4種成分都具備良好的效果。對80份以牛肉為主的市售樣品進行摻假鑒別，可敏感、特異、準確的檢出牛肉制品中摻入的豬、馬、雞成分。

本試驗建立了敏感性高、特異性強的4種肉類成分多重PCR鑒定方法，該方法可有效縮短和簡化肉制品摻假鑒定的步驟，比普通PCR技術提高了檢測通量，比實時熒光PCR技術節約了檢測成本。