安卡拉病毒PCR檢測方法的建立

李喬斌 ， 張云丹 ， 何 玲 ， 岳 筠 ， 李 梅 ， 謝曉東 ， 程振濤,3

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州貴陽550025 ； 2.貴州省動物疫病預防控制中心 ， 貴州貴陽550008 ； 3.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室 ， 貴州貴陽550025)

心包積液-肝炎綜合征(Hydropericardium-hepatitis syndrome,HHS)最早發現于巴基斯坦安卡拉地區，故又稱為安卡拉病，該病的病原是禽腺病毒，而引起此病癥狀的屬于Ⅰ群禽腺病毒[1]，該病毒主要感染雞群。感染病例臨床病理特征主要為心包積液和肝炎，因此，也稱為HHS[2]。該病先后流行于巴基斯坦、印度、韓國等亞洲地區和秘魯、智利、墨西哥等美洲地區。自2015年，該病在中國多省份暴發流行[3-4]，2016年以來貴州省也先后有多地出現疑似病例[5]。該病發病急，傳播速度快，病死率高，死亡率為30%～80%，臨床上易與其他禽類免疫性疾病產生協同作用，引起混合感染[6]，給該病檢測帶來困難，因此，建立一種快速、高效、特異的檢測方法顯得十分必要。本試驗基于Ⅰ群禽腺病毒血清4型 (FAdV-4)hexon基因，構建可快速檢測安卡拉病毒核酸的檢測方法，將為該病原流行病學研究、致病機理研究、預警預報提供關鍵技術。

1 材料與方法

1.1 毒株與樣本 FAdV-4標準毒株，由貴州福斯特生物科技有限公司提供。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、雞痘病毒(Fowl pox virus，FPV)、傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)和傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)等疫苗，均購自揚州威克生物科技有限公司；減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)和H9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)等疫苗，均由貴州福斯特生物科技有限公司提供。臨床疑似HHS病例組織樣本(肝臟)材料采集自貴州省某養雞場。

1.2 試劑 RNA/DNA提取通用試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DL-2 000 DNA Marker，均購自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 引物設計與合成 根據安卡拉病毒主要結構蛋白六鄰體(Hexon)基因序列，應用Primer Pemier 5.0軟件設計合成1對引物FAdV-4 F/R，引物序列見表1，預期擴增片段大小為295 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物稀釋成濃度為10 pmol/μL，于-20 ℃保存備用。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 FAdV-4 PCR檢測方法體系構建 初步建立FAdV-4 PCR檢測方法25 μL反應體系：DNA模板2 μL，PCR Mix 12.5 μL，引物FAdV-4-F/R各1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.5 PCR檢測方法反應條件的優化 以提取的FAdV-4 DNA為模板，建立25 μL PCR反應體系，分別對模板濃度、退火溫度進行優化。模板濃度設定：DNA模板質量濃度分別為2.19×10-2、4.38×10-2、8.78×10-2g/L和1.76×10-1g/L；退火溫度梯度為：56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃ 和64 ℃。根據上述模板濃度和退火溫度的設計方案，確定最佳PCR反應條件。

1.6 PCR檢測方法的性能評估

1.6.1 敏感性檢測 將提取的FAdV-4 DNA模板采用核酸蛋白測定儀測定其初始濃度，按10倍梯度倍比稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系列濃度梯度，應用構建的PCR方法最佳反應條件進行目的基因擴增，擴增產物于1.2%的瓊脂凝膠電泳觀察結果，以出現DNA電泳條帶為判定標準，評估該方法的敏感性。

1.6.2 特異性檢測 分別提取1.1中的疫苗株模板應用建立的PCR方法進行目的基因擴增，同時設FAdV-4為陽性對照，去離子水為陰性對照。擴增產物于1.2%的瓊脂凝膠電泳觀察結果，評估該方法的特異性。

1.6.3 臨床應用性檢測 取10份臨床疑似病例肝臟組織提取DNA樣本，應用構建的PCR方法進行目的基因擴增，同時設FAdV-4標準毒株樣本為陽性對照，去離子水為陰性對照。擴增產物于1.2%的瓊脂凝膠電泳觀察結果，評估該方法的臨床應用效果。

2 結果

2.1 PCR方法體系的構建 以初步建立的25 μL普通PCR反應體系和反應條件對目的基因進行PCR擴增，PCR產物電泳結果見圖1。由圖1可見，所建立的PCR反應體系能擴增出大約295 bp的目的基因條帶，與預期相符。

圖1 FAdV-4樣本PCR檢測Fig.1 Detection of FAdV-4 samples by PCRM：DL-2 000 DNA marker； 1～3：FAdV-4樣本； 4：陰性對照M：DL-2 000 DNA marker； 1～3：FAdV-4 samples； 4：Negative control

2.2 PCR反應條件的優化 由圖2可知，當模板質量濃度稀釋為2.19×10-2g/L時，擴增條帶很弱，而當濃度為4.38×10-2g/L時擴增條帶最明顯，因此，最佳模板質量濃度確定為4.38×10-2g/L。由圖3可知，在退火溫度為58 ℃時，擴增條帶最亮，隨著溫度升高，條帶減弱，因此最終確定58 ℃為最佳退火溫度。

圖2 模板質量濃度的優化Fig.2 Optimized of template concentrationM：DL-2 000 DNA marker； 1～4：模板濃度分別為2.19×10-2、4.38×10-2、8.78×10-2 g/L和1.76×10-1g/LM：DL-2 000 DNA marker； 1～4：The concentrations of templates are 2.19×10-2, 4.38×10-2, 8.78×10-2 g/L and 1.76×10-1 g/L

圖3 退火溫度的優化Fig. 3 Optimization of annealing temperatureM：DL-2 000 DNA marker； 1～5：退火溫度分別為56、58、60、62 ℃和64 ℃M：DL-2 000 DNA marker； 1～5: Annealing temperatures are56,58,60,62 ℃ and 64 ℃

2.3 PCR方法性能評估

2.3.1 PCR方法敏感性 經核酸蛋白測定儀測定FAdV-4模板濃度為4.38×10-2g/L，以此模板濃度稀釋至10-6倍，應用最佳PCR反應體系和反應條件對10倍倍比稀釋的系列濃度DNA樣本進行檢測，結果見圖4。由圖4可見，在稀釋倍數10-4時還出現微弱的擴增條帶，至10-5稀釋度時，無明顯擴增條帶。因此，建立的PCR方法最低檢測FAdV-4病毒核酸濃度為4.38×10-6g/L。

圖4 敏感性檢測Fig.4 Sensitive detectionM: DL-2 000 DNA marker； 1～7: 模板DNA稀釋倍數分別為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6； 8:陰性對照M：DL-2 000 DNA marker； 1～7：Template dilutions are 100,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 and 10-6； 8:Negative control

2.3.2 PCR方法特異性 由圖5可見，FAdV-4核酸樣本擴增出與預期大小相符的條帶，而其他6種病毒核酸樣本均無基因擴增條帶，表明建立的PCR方法有較好的特異性。

圖5 特異性檢測Fig. 5 Specificity detectionM：DL-2 000 DNA marker； 1：血清4型禽腺病毒； 2：新城疫病毒； 3：雞痘病毒； 4：傳染性支氣管炎病毒； 5：雞傳染性法氏囊病病毒； 6：減蛋綜合征病毒； 7：H9亞型禽流感病毒M：DL-2 000 DNA marker； 1：FAdV-4; 2：NDV; 3：FPV; 4：IBV; 5：IBDV; 6：EDSV; 7：AIV H9 subtype

2.3.3 臨床樣本檢測 取10份臨床疑似病例肝臟組織提取DNA樣本，評估所建PCR方法的臨床應用性，結果見圖6。由圖6可見，除陽性對照外，10份樣本中有6份樣本擴增出與預期相符的目的條帶，檢測陽性率為60%(6/10)，說明本試驗建立的PCR方法可用于FAdV-4臨床樣本檢測。

圖6 臨床樣本檢測Fig.6 Detection of clinical samplesM： DL-2 000 DNA marker； +：陽性對照;1～10：臨床樣本； -：陰性對照M：DL-2 000 DNA marker； +：Positive control； 1～10：Clinical samples； -：Negative control

3 討論

安卡拉病毒屬于腺病毒科禽腺病毒屬(I亞群禽腺病毒)禽腺病毒C種血清4型(FAdV-4)，該病毒在病毒粒子結構形態、培養特性、理化特性等方面無法有效與其他禽腺病毒鑒別。禽腺病毒分為3個群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，5個種 (A～E) 和12個血清型[7]。不同血清型禽腺病毒間具有一定的免疫交叉反應，但不足以產生交叉保護。因此要實現各血清型禽腺病毒所致疫病的及時預警和有效防控，仍需對各種禽腺病毒類型作出及時有效的檢測。安卡拉病毒感染主要引起心包積液和肝炎，還可引起蛋雞產蛋下降。臨床上安卡拉病毒病易與雞包涵體肝炎病混淆，且易與禽白血病、傳染性法氏囊病、大腸桿菌病等混合感染[8-9]，這些因素導致難以基于臨床癥狀對該病作出確切性診斷，因此，高效、快捷的實驗室檢測方法的建立對實現該病的早發現、早防控起到了關鍵作用[10]。鑒于本病在貴州省的流行現狀，本文建立了可用于FAdV-4快速檢測、組織嗜性、病毒含量等研究的檢測方法，為安卡拉病毒病的診斷、研究提供了科學依據。

目前，可用于FAdV-4的檢測方法有血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等血清學試驗[11]。這些方法快速、操作簡單，但易出現假陽性和交叉反應?；赑CR病原核酸檢測的分子生物學方法具有快速、靈敏等優點，包括PCR檢測技術、LAMP、q-PCR等，這些技術各有優缺點[12-13]，均可用于檢測FAdV-4。目前，安卡拉病毒檢測尚無技術規范，但有研究針對安卡拉病毒Penton基因建立PCR檢測方法[14]，而本試驗基于安卡拉病毒Hexon基因，選擇保守區域建立PCR檢測技術，性能評價顯示具有良好的特異性、敏感性，該方法不僅可用于病例的快速診斷，也可基于纖突蛋白的致病相關性開展病毒組織嗜性研究。PCR檢測技術因具有特異性、敏感性，在醫藥衛生、農業科學和生物學等領域得到廣泛應用[15]，本文建立的安卡拉病毒PCR檢測方法性能分析也具有較好的敏感性，最低檢測FAdV-4病毒核酸濃度為4.38×10-6g/L,根據DNA拷貝數的計算公式，可得靈敏度為2.03×105拷貝/μL，較Brownie等[16]建立的PCR檢測靈敏度103～104拷貝/μL更敏感。本文在設計引物時，通過對不同血清型禽腺病毒Hexon基因進行序列比對，選擇了609～904 bp保守區域片段，具有血清型特異性，能有效區分不同禽腺病毒血清型，保障所建方法的特異性[17]。