副豬嗜血桿菌試驗感染KM小鼠及在其體內的分布

王麗榮 ， 董永軍 ， 張守平 ， 樊俊洋 ， 李任峰 ， 王振偉 ， 李 玲 ， 王三虎

(河南科技學院動物科技學院 ， 河南 新鄉 453003)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,Hps)屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，革蘭陰性多形性桿菌，能引起豬的格氏病，表現漿膜炎、關節炎和腦炎的一種高度接觸性呼吸道傳染病。根據瓊脂擴散(Kieletein-rapp-gabriedson,KRG)血清分型方法，Hps分為15種血清型，且不同的血清型其毒力有一定的差異，血清型1、5、10、12、13、14具有高致病力，能夠引起動物死亡 ； 血清型2、4、8、15具有中等毒力，能夠引起豬的多發性漿膜炎，但并不引起死亡 ； 但是血清型3、6、7、9、11不引起明顯的臨床癥狀和病理損傷[1]。

Hps生物學特性復雜，目前國內對此病的報道多在病原分離鑒定、血清學調查、診斷技術和疫苗研制等方面，而有關Hps致病機理方面的研究很少報道，其致病機理和毒力因子至今尚不完全清楚。構建穩定、可靠的活體感染模型是深入研究這些問題的關鍵。而常規的飼養豬復制Glasser’s病例，結果很難達到預期效果，且生產成本高也不易飼喂。國內外學者曾使用禁食初乳豬[2-3]、自然分娩未食初乳豬[4]作為實驗動物，但由于其對試驗條件要求和成本均較高，使得其實際研究有局限性，并不現實。SPF仔豬即Hps陰性仔豬，也曾被應用于Hps的活體感染模型，但目前條件下Hps陰性豬群已經很難找到，而且該方法同樣對技術要求高，致使成本昂貴，操作難度更大且不可靠，其應用研究有局限性[5-6]。因此，很多學者探索用經典的實驗動物小鼠作為替代動物模型研究Hps的相關機理。

本試驗用Hps河南地區臨床分離野毒株和血清5型標準毒株采用腹腔、灌胃感染實驗動物小鼠，通過觀察發病或死亡情況和病原再分離，探索河南野毒株對KM小鼠的致病力，并檢測Hps在KM小鼠體內的分布，比較不同接種途徑對KM小鼠致病的差異，評價Hps河南地區野毒株和血清5型標準株對KM小鼠的致病性，以選擇一種經濟、穩定及易操作的感染模型，構建副豬嗜血桿菌的動物感染KM模型，為深入研究Hps的致病機制、免疫及疾病防控等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白大豆肉湯(TSB)，均購自鄭州久是生物技術有限責任公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，購自廣東美津生物技術有限公司；犢牛血清，購自北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.2 菌株、實驗動物 副豬嗜血桿菌標準菌株血清5型(BZ)，購自中國獸醫藥品監察所菌種毒種保藏中心；河南野毒株血清5型(YD)由河南科技學院預防獸醫學實驗室分離鑒定凍存。

昆明(KM)小鼠，雌性，體重18～20 g，購自新鄉醫學院實驗動物研究中心。

1.3 動物感染試驗 KM小鼠隨機分為6組，每組7只，其中1～2組為灌胃(ig)感染組，3～4組為腹腔(ip)注射感染組，5～6組為對照組。

將2個Hps菌株分別接種含10%犢牛血清、0.1%NAD的TSB培養基，37 ℃、150 r/min搖床培養16 h，將培養物配制成1×109CFU劑量，采用灌胃、腹腔注射2種途徑感染小鼠[7-8]，接種劑量為腹腔注射每只0.5 mL，灌胃每只0.5 mL，對照組滅菌生理鹽水，每只0.5 mL。

不同接種途徑感染小鼠后，觀察小鼠出現的臨床癥狀，記錄小鼠死亡數及出現的病變和Hps分離培養情況。未死亡小鼠觀察1周剖檢，觀察病變和Hps分離培養，比較不同菌株對小鼠敏感性的差異。

1.4 臨床和病理觀察 感染后臨床連續觀察7 d，記錄實驗動物的臨床表現；對死亡小鼠及未死亡小鼠攻毒7 d后進行剖檢，觀察剖檢病變，并記錄結果。

1.5 細菌在感染動物體內分布的測定 副豬嗜血桿菌分別感染各組小鼠，感染后死亡及未死亡小鼠于7 d脫臼法迫殺小鼠，無菌取脾臟、肝臟和肺臟，剪一小塊組織稱重后利用組織研磨器研磨，以無菌PBS稀釋，取勻漿液均勻涂布于含新生牛血清和NAD的TSA平板上，每個稀釋度做3個重復，37 ℃培養過夜，同時取胸腔滲出液、心血，無菌PBS稀釋后涂板培養。

2 結果

2.1 不同途徑感染小鼠結果 感染后連續觀察受試動物7 d，發現Hps腹腔感染小鼠2 h左右出現精神不振，食欲下降，被毛豎立，肌肉震顫，并出現扎堆現象，見中插彩版圖1；至5 h左右時，小鼠肌肉震顫漸漸消失，被毛豎立現象消失，依舊扎堆；其中有河南野毒株感染小鼠于43 h、50 h各死亡1只，即感染小鼠2/7死亡，標準菌株感染后44 h死亡1只，即1/7死亡。灌胃感染小鼠4 h左右出現上述癥狀，其中只有河南野毒株組46 h死亡1只。對照組小鼠正常。結果見表1、圖2。

表1 感染小鼠死亡情況Table 1 Death of infected mice (只)

圖2 感染小鼠的死亡率Fig.2 Death rate of infected miceA:腹腔感染； B:灌胃感染A:Abdominal infection; B:Intragastric infection

剖檢發現，1～2組小鼠腹腔感染后，河南野毒株感染死亡的小鼠胸腔有積液，肺臟有出血點，胸腔有黑色血凝塊，腹腔有輕微粘連，且其他臟器無明顯變化；標準菌株感染組小鼠胸腔積液，肺臟出血，其他無明顯變化。3～4組小鼠灌胃感染河南野毒株后，死亡小鼠剖檢病變同腹腔感染組，見中插彩版圖3。

2.2 病原分離結果 無菌取各組死亡和存活小鼠的胸腔積液、心血、肝臟、脾臟、肺臟，進行病原分離，測定其在組織臟器的分布，結果顯示，河南野毒株和標準菌株均是腹腔感染組小鼠在心血和胸腔積液中分離到Hps，在肝臟、脾臟、肺臟中未分離到Hps；2菌株灌胃感染組小鼠和對照組小鼠的胸腔積液、心血、肝臟、脾臟、肺臟均未分離到Hps。見表2。

表2 感染小鼠Hps分離情況Table 2 Isolation of Hps from infected mice

3 討論

副豬嗜血桿菌是豬群上呼吸道的一種常在定居菌，具有明顯的地域特征，能夠突破黏膜屏障導致全身性感染，其毒力是相對的，有時取決于豬感染的劑量和個體的易感性，毒力的差異所引起的保護性免疫應答能力也不相同，但目前Hps已成為豬場保育仔豬死亡的一個主要因素，其致病機理和毒力因子尚未完全清楚，Hps人工感染動物為闡明該病原菌的致病機理和尋找毒力因子提供了手段。Hps一般出現在混合感染的病例中，因此學者們通常認為Hps是某些疫病(如PCV2感染、Mhp感染或PRRSV感染)的繼發病原，其原因是PCV2 或PRRSV能誘導感染動物免疫抑制，為細菌的繼發感染創造條件，所以普通條件下感染該動物，不理想或重復性很差，用普通豬來作實驗動物感染，成功的機率很低。本試驗選用實驗動物KM小鼠為研究對象，通過腹腔、灌胃感染 Hps 血清5型標準菌株和河南野毒株的液體培養物后，觀察了受試動物的發病、死亡和病變情況，并對感染后各組織器官進行了Hps再分離，從而較系統的評估了 Hps 血清5型河南野毒株和標準毒株對常用實驗動物KM小鼠的致病性。從試驗的可操作性和經濟方面考慮，在本試驗中選用經典的實驗動物昆明小鼠，腹腔、灌胃感染組均出現死亡，從小鼠肝臟、脾臟、肺臟不容易再次分離到Hps，這與賀云霞等[1]的結論基本一致，但能從死亡小鼠胸腔滲出液、心血中再分離到Hps，這與李雪松等[9]在小鼠心血中分離到Hps的結果一致。表明Hps可對KM小鼠致病，能引起小鼠發病，說明2個菌株的毒力均較強；受試動物死亡率不高及細菌分離率不高可能與感染劑量有關，這為KM小鼠作為Hps的感染動物模型的候選動物奠定了基礎。

從出現的臨床癥狀、小鼠死亡數、多發性漿膜炎及 Hps 分離培養，評估腹腔和灌胃2個途徑感染的差異，表明腹腔感染優于灌胃感染組，且從試驗操作可行性方面，腹腔感染更為簡捷，易操作，這為研究Hps致病機理等提供了科學依據。