豬捷申病毒TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立和初步應用

秦毅斌 ， 蘇乾蓮 ， 趙 碩 ， 盧冰霞 ， 何 穎 ， 周展宏 ， 袁婷婷 ， 李 斌 ， 段群棚 ， 歐陽康 ， 趙 武

(1.廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室 ， 廣西南寧530001 ； 2.廣西大學動物科學技術學院 ， 廣西南寧530005)

豬捷申病(Porcine teschen disease，PTD)，又稱塔爾凡病或腦脊髓炎，是由豬捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV)感染引起的一種豬病毒性傳染病。該病首次于1929年在捷克斯洛伐克的捷申地區(qū)發(fā)現(xiàn)，故命名為“捷申病”，隨后傳播至北美、非洲、澳大利亞和日本等國家，目前已散布于世界各養(yǎng)豬國家[1]。豬群感染PTV后，主要表現(xiàn)為腹瀉、腦脊髓灰質炎[2]、肺炎、心包炎、心肌炎、皮膚損壞等癥狀，母豬還可導致繁殖障礙[3]，感染發(fā)病豬具有較高的病死率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大經(jīng)濟損失。

PTV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)捷申病毒屬(Teschovirus)成員，病毒粒子呈球形，外層包裹衣殼，無脂蛋白，病毒基因組為單股正鏈RNA，長約7.2 kb，僅含有1個完整的編碼1個多聚蛋白的開放閱讀框(ORF)，該多聚蛋白被蛋白水解酶裂解為非結構蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D和結構蛋白L、VP1、VP2、VP3、VP4[4-5]。PTV至少有11個血清型[6]，并且還不斷出現(xiàn)新的血清型PTV12[7]、PTV13[8]。研究表明，我國豬群PTV感染較為普遍。2003年，哈爾濱獸醫(yī)研究所從內蒙古某豬場首次分離到PTV Swine/CH/IMH/03株[9]，之后相繼分離到JF613株、jilin/2003株、HB株、Fuyu/2009株和CH/JX/JJ株等多個毒株并進行全基因組測序分析[10-13]。

為建立更為敏感、特異、快速的PTV檢測方法，本試驗通過GenBank中登錄的PTV的11種血清型基因序列并進行比對分析，以AF231769為模板在保守區(qū)域基因組5′非編碼區(qū)設計合成特異性引物和TaqMan探針，優(yōu)化反應條件后，建立了檢測PTV的一步法RT-qPCR方法，并對采自廣西各地的豬腹瀉病例糞樣進行PTV初步檢測應用。

1 材料與方法

1.1 毒株 PTV、豬丁型冠狀病毒(PDCoV)1468B株[14]、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)750A株[15]、豬細小病毒(PPV)N株[16]，均為廣西獸醫(yī)研究所病毒研究室分離保存；豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、A群豬輪狀病毒(PRoVA)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬嵴病毒(PKV)及豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)等陽性樣品均為本實驗室保存。

1.2 臨床樣品 235份糞樣及腸道組織為2018年3月—2019年4月采自廣西各地發(fā)生豬腹瀉病例的規(guī)模豬場。

1.3 主要儀器和試劑 實時熒光定量PCR儀QuantStudioTM5為美國應用生物技術公司(ABI)產(chǎn)品；梯度PCR儀為美國伯樂(BioRad)公司產(chǎn)品；分光光度計(UV-2450)購自日本島冿科技公司。pMD18-T載體、反轉錄試劑盒、一步法RT-qPCR試劑盒[One Step PrimeScriptTMqRT-PCR Kit(Perfect Real Time)]、DNA凝膠回收試劑盒等，均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；病毒DNA/RNA抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品；質粒小量抽提試劑盒、2×TaqPCR Master，均購自北京天根生化科技有限公司；E.coliDH5α感受態(tài)細胞為全式金科技公司產(chǎn)品。

1.4 引物及探針的設計 根據(jù)GenBank上登錄的11種血清型PTV的基因組序列進行序列比對確定保守區(qū)域，以PTV Talfan株(AF231769)的基因組序列為模板，在保守區(qū)域基因組5′非編碼區(qū)設計2對特異性引物和TaqMan探針，其中引物PTV-F、PTV-R用于擴增保守區(qū)域并構建重組質粒，引物PTV-R-F、PTV-R-R和探針PTV-Probe用于熒光定量反應。引物序列見表1，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5 糞便樣品的處理及病毒RNA的提取 糞便樣品及腸道內容物按照1∶10比例用PBS(0.01 mol/L, pH 7.2)稀釋制成的懸液，渦旋震蕩充分混勻后，4℃ 10 000 r/min離心10 min后收集上清，立即用于RNA提取或置于-40℃凍存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)Axygen生物科技有限公司DNA/RNA提取試劑盒說明書進行PTV病毒液或者樣品上清核酸的提取。

1.6 pMD18-PTV質粒標準品的制備 以PTV分離毒株提取的RNA為模板，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。用引物PTV-F和PTV-R進行PCR擴增PTV基因組5′端保守區(qū)域的片段，50 μL反應體系：2×TaqPCR Master 25 μL、上下游引物各1 μL(表1)、cDNA模板4 μL，加ddH2O 補足50 μL。反應程序: 95 ℃ 5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后12 ℃結束反應低溫保存。PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段切膠回收純化后連接至pMD18-T克隆載體，轉化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，提取重組質粒進行酶切鑒定及PCR鑒定，陽性質粒pMD18-PTV送寶生物工程(大連)有限公司進行測序。

表1 引物和TaqMan探針序列Table 1 Primers and TaqMan fluorescent probe

1.7 一步法RT-qPCR反應條件與體系優(yōu)化 按照試劑盒推薦說明書進行PTV一步法RT-qPCR擴增反應并進行優(yōu)化。反應體系預設為20.0 μL，包括2×One-Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRaExTaqHS(5 U/μL)0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，引物PTV-R-F、PTV-R-R各0.4 μL，探針PTV-Probe 1 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、RNA模板2.0 μL，加ddH2O 5.2 μL補足20.0 μL。反應程序: 42 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，45個循環(huán)；每個循環(huán)延伸結束時采集熒光信號。將引物和探針在終濃度為0.2～0.8 μmol/L 范圍內進行濃度優(yōu)化，以確定一步法熒光定量RT-PCR反應的最佳引物和探針濃度。

1.8 標準曲線的建立 參照文獻[17]的方法，根據(jù)測定的質粒核酸濃度計算質粒標準品的拷貝數(shù)，計算公式：拷貝/mL =(6.02×1023拷貝/mol)×(質粒濃度)/(MWg /mol)。將質粒標準品10倍 倍比系列稀釋成含有4.6×108～4.6×102拷貝/μL的7個梯度，以此作為模板按照所建立及優(yōu)化的一步法RT-qPCR反應進行擴增。以Ct值為縱坐標，以不同濃度標準品拷貝數(shù)的常用對數(shù)為橫坐標，推導出標準線性回歸方程，進而繪制標準曲線。

1.9 敏感性試驗 分別以4.6×100～4.6×109拷貝/μL 濃度的標準質粒pMD18-PTV作為模板，對該方法的敏感性進行測定，以確定所建立的PTV一步法RT-qPCR方法的最低檢測下限。

1.10 特異性試驗 利用所建立的方法，以PTV為陽性對照，同時檢測TGEV、PEDV、PDCoV、PRRSV、PKV、PRoVA、CSFV、PPV、PRV、PCV-2等常見的豬病毒，以驗證該方法的特異性。

1.11 重復性及穩(wěn)定性試驗 取質粒標準品pMD18-PTV的低、中、高(4.6×102、4.6×104、4.6×106拷貝/μL)3個濃度作為模板，用優(yōu)化后的一步法RT-qPCR進行檢測，每個濃度設3個重復，根據(jù)各稀釋度的Ct值計算標準差和變異系數(shù)，進行組內重復性試驗。將上述3個濃度的標準質粒保存于-20℃ 冰箱，之后每間隔1周以相同的反應條件進行檢測，連續(xù)做3次，計算各濃度模板Ct值的標準差和變異系數(shù)，來驗證該方法的穩(wěn)定性及組間重復性。

1.12 臨床樣品的檢測 對235份來自廣西各地不同規(guī)模養(yǎng)豬場腹瀉病例的糞便樣品或腸道內容物，應用本試驗建立的PTV一步法RT-qPCR方法進行檢測，同時與先前普通RT-PCR的檢測結果進行比較，了解廣西豬群PTV的感染狀況。

2 結果

2.1 反應體系與反應條件優(yōu)化 通過對反應體系中引物與探針濃度的優(yōu)化，確定了一步法RT-qPCR檢測PTV的最佳反應體系：2×One-Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRaExTaqHS(5 U/μL)0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，引物PTV-R-F(10 μmol/L)、PTV-R-R(10 μmol/L)各0.4 μL，探針PTV-Probe(2 μmol/L)1 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、RNA模板2.0 μL，加ddH2O 5.2 μL補足20.0 μL。優(yōu)化后的反應程序如下：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，45個循環(huán)。

2.2 RT-qPCR標準曲線 紫外吸收法測定重組質粒pMD18-PTV質量濃度為144 ng/μL，經(jīng)計算拷貝數(shù)為4.6×1010拷貝/μL。以10倍系列稀釋的標準pMD18-PTV重組質粒(4.6×108～4.6×102拷貝/μL)為模板進行TaqMan實時熒光定量PCR反應，熒光定量PCR在4.6×108～4.6×102拷貝/μL具有良好的線性關系(圖1)。根據(jù)檢測結果所計算出的標準曲線見圖2，曲線相關系數(shù)為0.996，斜率為-3.201，截距為40.527，從而可以得出拷貝數(shù)(X)與Ct值之間的線性關系表達式為：Ct=-3.201×logX+40.527。根據(jù)被檢樣本產(chǎn)生的Ct值代入上述表達式即可計算出初始拷貝數(shù)。

圖1 質粒模板標準品10倍倍比稀釋RT-qPCR擴增曲線Fig.1 Detection results of the recombinant plasmid pMD18-PTV with 10 fold serial dilution by the RT-qPCR assay1～8：重組質粒模板濃度分別是4.6×109、4.6×108、4.6×107、4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103拷貝/μL和4.6×102拷貝/μL； 9：ddH2O1～8: RT-qPCR results of the recombinant plasmid pMD18-PTV concentrations of 4.6×109，4.6×108，4.6×107，4.6×106，4.6×105，4.6×104，4.6×103 copies/μL and 4.6×102 copies/μL,respectively； 9:ddH2O

圖2 PTV RT-qPCR 標準曲線的建立Fig.2 Establishment of the standard curve with recombinant plasmid

2.3 敏感性試驗 用建立的PTV一步法RT-qPCR檢測方法對4.6×109～4.6×100拷貝/μL的標準質粒pMD18-PTV進行敏感性試驗。結果顯示，該方法的最低檢下限為4.6×101拷貝/μL的質粒模板(圖3)。

圖3 RT-qPCR敏感性試驗結果Fig.3 The sensitivity test results of RT-qPCR1～10：重組質粒模板濃度分別是4.6×109、4.6×108、4.6×107、4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103、4.6×102、4.6×101拷貝/μL和4.6×100拷貝/μL； 11：ddH2O1～10: RT-qPCR results of the recombinant plasmid pMD18-PTV concentrations of 4.6×109，4.6×108，4.6×107，4.6×106，4.6×105，4.6×104，4.6×103，4.6×102，4.6×101 copies/μL and 4.6×100 copies/μL,respectively； 11:ddH2O

2.4 特異性試驗 利用建立的RT-qPCR檢測PTV及其他幾種相關的豬疫病病毒，僅PTV呈陽性，出現(xiàn)特異性熒光擴增曲線，PDCoV、PEDV、TGEV、PRoVA、PKV、PRV、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV及陰性對照均為陰性，表明該方法具有良好的特異性(圖4)。

圖4 RT-qPCR特異性試驗結果Fig.4 Specificity test results of RT-qPCR1: PTV陽性對照； 2～11: PEDV，TGEV，PDCoV，PRoVA，PKV，PRV，CSFV，PRRSV，PCV-2，PPV； 12：ddH2O陰性對照1: PTV positive control; 2～11: PEDV,TGEV,PDCoV,PRoVA,PKV,PRV,CSFV,PRRSV,PCV-2,PPV; 12: ddH2O negative control

2.5 RT-qPCR重復性分析 將建立的RT-qPCR檢測方法進行重復性試驗。分別以4.6×102、4.6×104、4.6×106拷貝/μL的低、中、高濃度的標準質粒pMD18-PTV作為模板，進行3次組內與組間RT-qPCR反應擴增。結果顯示，同一模板濃度的Ct值都很穩(wěn)定，組內與組間的3次重復的變異系數(shù)(CV)均小于4%(表2)，說明具有良好的穩(wěn)定性和可重復性。

表2 RT-qPCR重復性試驗結果Table 2 Repeatability test results of the RT-qPCR

2.6 臨床樣品的檢測 取2018年3月—2019年4月從廣西不同規(guī)模豬場收集的235份腹瀉病料，對本試驗建立的一步法RT-qPCR方法開展應用檢測。結果顯示，廣西腹瀉病例樣品中PTV的陽性率為13.62%(32/235)，比本實驗室先前建立的普通RT-PCR方法檢出率10.21%(24/235)稍高。普通RT-PCR方法檢測陽性的24份 樣品，RT-qPCR方法檢測為陽性且Ct值較小(15～27)；而用本試驗建立的RT-qPCR方法從普通RT-PCR方法檢測陰性的211份樣品篩查到8份為PTV陽性，但是它們的Ct值較大(30～35)。

3 討論

PTV最早發(fā)現(xiàn)于捷克斯洛伐克，1930—1950年間，歐洲有數(shù)千例PTV-1毒株引起的豬腦脊髓灰質炎暴發(fā)，使養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟損失。隨后其毒力逐漸改變，表現(xiàn)為腦脊髓炎的病例明顯減少，高致病性的毒株被弱毒株所取代[18]。目前，PTV有至少13個血清型，通常大多數(shù)毒株是引起無明顯臨床癥狀的隱性感染，但一些毒株感染可引起諸如腦脊髓炎、肺炎、腸炎及繁殖障礙等一系列相關病癥的疾病。

健康豬群中PTV亞臨床感染較為普遍[19]，可從無明顯臨床癥狀豬只的糞便乃至內臟器官中檢測到或者分離到該病毒，雖然病毒的毒力不強，但往往成為不被重視的傳染源，造成的危害亦不容忽視。

近些年來，對PEDV、TGEV和PDCoV的研究報道相對較多，而對PTV在引起腹瀉中扮演什么樣的角色仍然知之甚少。迄今已有多個血清型的PTV毒株相繼從發(fā)病豬的腸道或者內臟器官中分離出來，動物試驗亦證實這些PTV毒株可以引起豬只出現(xiàn)包括腹瀉在內的癥狀及相關的病理變化[10,12,20]。從攻毒豬的臨床表現(xiàn)及腸道病理變化來說，PTV與PEDV、TGEV、PDCoV引起的臨床癥狀表現(xiàn)極為相似，僅靠眼觀根本無法確定究竟是哪種病毒感染引起的腹瀉，因此需借助實驗室診斷來確定病原。針對PTV的檢測方法包括傳統(tǒng)的病毒分離、間接免疫熒光試驗(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫組化(IHC)等方法。病毒分離可靠，但耗時費力；免疫學試驗雖然敏感，但容易出現(xiàn)交叉反應。分子生物學檢測方法，尤其是熒光定量PCR方法，具有特異性強、耗時短等優(yōu)點。

熒光定量PCR技術于1996年由美國應用生物技術公司推出。實時熒光定量PCR是在熒光PCR基礎上的技術革新，其通過熒光信號檢測PCR產(chǎn)物，每一次PCR循環(huán)結束時收集一次熒光信號值，建立實時擴增曲線，精準地確定實時熒光定量PCR的Ct值，進而依據(jù)Ct值確定起始DNA模板拷貝數(shù)，真正做到DNA定量[21]。實時熒光定量PCR根據(jù)其原理及方法可以分為TaqMan探針、SYBR GreenⅠ熒光染料、分子信標和雜交探針等[22-23]。其中TaqMan探針法實時熒光定量PCR是高度特異的定量PCR技術，采用了引物和探針的“雙重保險”，探針與2條特異性引物擴增出來的目標DNA互補結合，并利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性，探針被切斷后熒光報告基團產(chǎn)生熒光信號，熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。實時熒光定量PCR比普通PCR具有更快速、便捷、特異、敏感以及定量檢測的特性，已廣泛用于人和動物各種疫病的臨床檢測。

本試驗建立的檢測PTV的RT-qPCR方法，具有良好的特異性，與常見的豬腸道致病病毒均無交叉反應。應用所建立的方法對采自廣西各地的235份腹瀉樣品進行檢測，PTV的陽性檢出率為13.62%，表明廣西部分豬場普遍存在PTV感染，應重視并加強對該病監(jiān)測及綜合防控；同時該方法比本實驗室先前建立的普通RT-PCR方法10.21%的檢出率高，說明該方法比普通PCR的敏感度更高。總之，本試驗所建立的RT-qPCR方法為PTV的檢測和病毒研究分析提供了一種快速、敏感和特異的技術手段，為進一步做好廣西PTD的檢測監(jiān)測、預警及防控提供了有力支撐。