雞血抗菌肽對保育豬生長及其免疫調節的研究

劉 輝 ， 佘銳萍 ， 劉天龍 ， 劉 波

(中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

血液抗菌肽是從動物的血紅蛋白α或β亞基上裂解而來的片段，具有抗菌等多種活性的水解產物[1]。其分子由15～30個氨基酸殘基組成，分子量低(不足10 kDa)。血紅蛋白抗菌肽是陽離子抗菌肽，呈現α螺旋構象，在水溶液或十二烷基硫酸鈉液體以隨機線圈形式存在[1-3]。這些特性決定了它們在微濃度下具有廣泛抑制微生物的能力[4-5]。血紅蛋白抗菌肽的作用方式是提高細胞膜的通透性[6-7]。

雞血抗菌肽(Chicken blood antimicrobial peptides，CBAP)屬于天然的禽源抗菌肽，是從雞新鮮血液中提取出大小為3.3 kDa雞血紅蛋白α鏈片段，被證明有廣譜的抗菌活性及家禽免疫調節與抗應激的功能[8]。抗菌肽(AMPs)對哺乳動物免疫力的重要性往往被低估，首先在植物和無脊椎動物中發現抗菌肽具備強大的免疫功能，隨著對哺乳動物天然免疫防御系統研究不斷深入，AMPs在哺乳動物免疫中的重要作用得到確認。在微生物病原體的刺激下，動物的細胞在感染或損傷局部部位釋放AMPs[9]。除了抑制微生物生長外，某些AMPs還可以直接募集白細胞或誘導趨化因子與細胞因子的分泌，從而間接促進單核細胞、巨噬細胞、未成熟樹突狀細胞和T細胞等效應細胞的募集。募集作用是通過與G蛋白偶聯受體介導的，將樹突狀細胞和T細胞招募到微生物入侵的部位，從而促進細胞免疫反應[10]。AMPs還可以調節動物的適應性免疫。如防御素作為有效的免疫佐劑，通過誘導淋巴因子的產生，促進T細胞依賴性細胞免疫和抗原特異性免疫球蛋白的產生[11]。

本次試驗重點探索CBAP對豬的促生長與免疫調節作用影響，為開發綠色無抗促生長添加劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材 CBAP是由本實驗室按照酶解法從新鮮雞血中提取所得，pH=6.0±0.5，濃度為300 μg/mL。豬外周淋巴細胞分離試劑盒，購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；進口胎牛血清，購自Nobimpex公司；DMEM，購自賽默飛世爾公司；1×PBS緩沖液(pH 7.2～7.4)，購自Solarbio公司；脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)、WST-8細胞技術試劑盒，均購自北京鈕因華公司；豬補體C3、C4 ELISA試劑盒、豬γ-干擾素ELISA試劑盒，均購自Dogesce公司；豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies，PR)gB抗體ELISA檢測試劑盒，購自Biochek公司；經典豬瘟(Classical swine fever，CSF)抗體ELISA檢測試劑盒，購自美國愛德士公司；豬口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)O型、A型液相阻斷ELISA檢測試劑盒，均購自金宇保靈生物藥品有限公司。

1.2 主要儀器 無菌超凈臺，美國Labconco公司產品；低速離心機LD5-2，北京醫用離心機廠產品；倒置式生物電子顯微鏡，北京東南儀誠公司產品；紫外分光光度計，Bio-rad公司產品；II級生物安全柜，山東博科生物產業有限公司產品；CO2細胞培養箱，Thermo公司產品；BKQP-100L立式高壓蒸汽滅菌器，山東鑫貝西公司產品；電熱恒溫培養箱，北京陸希科技有限公司產品。

1.3 實驗動物 65日齡美系純種杜洛克豬，購自北京六馬集團。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗時間與地點 2019年8月8日—2019年9月8日，共30 d，試驗地點為北京六馬集團順義豬場。

1.4.2 試驗設計 根據體重、健康狀況等同性原則隨機分為2組，每組10頭，對照組10頭(基礎日糧)，CBAP組10頭(基礎日糧+300 μg/mL、10 mL/d CBAP飲水)。CBAP通過10 mL的注射器(去掉針頭)直接注入豬的口腔里，飼料為干濕料，每天早、中、晚各加料1次，飼養試驗為30 d。考慮陽光因素，2組試驗都有陽面和陰面。基礎日糧為六馬集團生產加工的保育料，保育豬采用地面欄舍飼養，試驗期保持豬舍衛生、消毒。免疫按照豬場管理流程執行，試驗豬舍要適當通風，保持豬舍安靜。免疫程序見表1。

表1 保育豬免疫程序Table 1 Immunization program for nursery pigs

1.4.3 生長指標的測定 試驗過程中，每天觀察豬群2～3次，記錄保育豬腹瀉與死亡情況。(1)日增重：分別在試驗的第1天、第30天，早晨7:30左右空腹逐頭進行稱重，計算出試驗期間仔豬的日增重。試驗期日增重/頭=(試驗末欄平均重-試驗初欄平均重)/試驗天數；(2)平均日采食量：以欄為單位，每欄每天總采食量，連續相加30 d，再求平均值。平均日采食量=采食量/飼養天數；(3)死亡率：30 d內死亡頭數/每欄總頭數×100%；(4)飼料料肉比=頭平均采食量/頭平均日增重；(5)腹瀉頭數：每天查看豬群狀態，統計腹瀉發病情況與數量。

1.4.4 免疫指標測定 (1)在試驗第0、10、20天和第30天各組分別對固定的5頭豬(準備屠宰)進行采血，分離血清，標記好，4 ℃保存，一并測定豬瘟(CSF)、狂犬病(PR)、豬口蹄疫(FMD)3種抗體和細胞免疫指標(血清補體C3、C4，γ-干擾素);(2)采集8頭豬的脾臟，制作脾淋巴細胞，測定淋巴細胞轉化率。抗體檢測與脾淋巴細胞提取按照試劑盒說明書步驟完成。

1.5 數據分析 使用Graphpad prism 8.0軟件進行顯著性差異分析與圖表繪制,以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 CBAP對保育豬生長指標的影響 使用CBAP對豬群進行30 d的飼喂，如表2與圖1所示，試驗末平均體重，CBAP組比對照組多3.42 kg，增重了8.2%，差異顯著(n=10，P<0.05)。CBAP組的平均日增重比對照組多88 g/d，提高了13.7%，差異顯著(n=10，P<0.05)。CBAP組料肉比與對照組相比下降0.18，下降了10.4%，差異顯著(n=10，P<0.05)。 說明CBAP對豬群的生長有很好的促進作用，在采食量大體一致的情況下(1 050 g/d vs 1 103 g/d)， CBAP組有更好的飼料轉化率。從控制腹瀉角度來說，對照組在試驗期間共出現4頭腹瀉豬只，而CBAP組只有1頭，差異顯著(n=10，P<0.05)。說明CBAP對控制豬群腹瀉效果較為明顯，這可能與維持豬群腸道健康有關。

圖1 CBAP對保育豬生長指標的影響Fig.1 Effect of CBAP on growth indexes of nursery pigs*：P<0.05，差異顯著； 無標記：P>0.05，差異不顯著;下同*:P<0.05,the difference was significant; No marker:P>0.05, the difference was not significant. The same as below

表2 CBAP對保育豬生長指標的影響Table 2 Effects of CBAP on growth indexes of nursery pigs

2.2 CBAP對保育豬血清中免疫指標的影響 在試驗第0、10、20天和第30天分別采集對照組和CBAP組各5頭豬血清，測定補體C3、C4、γ-干擾素。結果見圖2。血清補體C3(n=5)的結果見圖2A，在第20～30天的CBAP組血清補體C3濃度顯著高于對照組(P<0.05)，而在試驗開始到20 d，CBAP組與對照組差異不顯著(P>0.05)；血清補體C4(n=5)的結果見圖2B，與C3結果一致，也是在第20～30天 的CBAP組中的血清補體C4濃度顯著高于對照組(P<0.05)。 其他時間效果與對照組不顯著(P<0.05)。 γ-干擾素結果如圖2C，在第10天及第20天2個時間點CBAP組與對照組差異都不顯著(n=5，P>0.05)，而在試驗第30天CBAP組豬血清中的γ-干擾素明顯高于對照組(P<0.05)。

圖2 CBAP對保育豬天然免疫指標的影響Fig.2 Effect of CBAP on innate immune indexes of nursery pigsA：血清補體C3； B：血清補體C4； C：γ-干擾素A:Serum complement C3; B:Serum complement C4; C:Interferon-γ

2.3 CBAP對保育豬脾淋巴細胞增殖的影響 飼喂CBAP 30 d，豬淋巴細胞增殖作用結果如圖3所示，由ConA刺激的T淋巴細胞的轉化率(n=4)的結果顯示，CBAP組要極顯著高于對照組(P<0.01)，由LPS刺激的脾B淋巴細胞增殖作用(n=4)顯示，CBAP組要極顯著高于對照組(P<0.01)，與T淋巴細胞的轉化率結果一致。

圖3 豬脾淋巴細胞轉化試驗Fig.3 Lymphocyte transformation test of pig spleen

2.4 CBAP對保育豬體液免疫指標的影響 試驗期的第0、10、20天和第30天分別采集對照組和CBAP組各5頭豬只血清，檢測豬瘟，偽狂犬gB，口蹄疫O型、A型抗體，具體結果如下：CBAP對豬瘟疫苗的效果如中插彩版圖4A所示，與對照組相比，CBAP對豬瘟的抗體效價與合格率均無明顯改善，差異不顯著(n=5，P>0.05)，這可能由于CBAP對活豬瘟疫苗病毒有一定的影響，導致對疫苗抗體效果提高不明顯。CBAP對豬偽狂犬疫苗的效果如中插彩版圖4B所示，與對照組相比，在第30天gB抗體效價差異顯著(n=5，P<0.05)，其他時間段差異不顯著。CBAP對偽狂犬滅活苗產生抗體有很好的促進作用。CBAP對豬口蹄疫疫苗O型抗體的效果如中插彩版圖4C所示，本場口蹄疫疫苗第1次免疫在60 d，第2次免疫在90 d，飼喂CBAP 30 d后，CBAP組對豬口蹄疫O型抗體滴度有明顯的改善作用，在第10天CBAP組抗體滴度極顯著高于對照組(n=5，P<0.01);在第20天與第30天采血檢查，CBAP組抗體滴度顯著高于對照組(n=5，P<0.05)。CBAP對豬口蹄疫疫苗A型抗體的效果如中插彩版圖4D所示，試驗期間的第10天與第30天CBAP組要明顯優于對照組，抗體效價差異極顯著(n=5，P<0.01)。第20天CBAP組顯著高于對照組，抗體效價差異顯著(n=5，P<0.05)。說明CBAP可很好地促進口蹄疫A型抗體產生。

3 討論

3.1 抗菌肽對豬群的促生長作用 抗生素作為動物飼料促生長添加劑已有50多年的歷史。然而，飼料中抗生素增加動物機體產生耐藥性機會，天然抗菌肽不但可以促進動物生長，提高各項免疫指標，且作用穩定，安全可靠，是理想的促生長添加劑替代品。本次試驗選用大保育豬作為研究應用對象，體重在20 kg以上，每天每頭飼喂300 μg/mL、10 mL/d，經過1個月飼喂周期，與對照組相比，日增重提高了13.7%，料肉比下降了10.4%，腹瀉率下降了30%。表現出較好的促生長和抗腹瀉效果。

3.2 抗菌肽對豬群的免疫促進作用 抗菌肽的免疫增強活性一直是研究的熱點之一，其獨有的雙重平衡機體特性，可以直接通過抗菌活性和刺激固有免疫功能(炎癥、傷口修復和適應性免疫系統的調節)保護宿主免受潛在有害病原體的侵害。同時，還保護機體免受過度炎癥反應的有害影響。本試驗從下面兩個方面討論抗菌肽與免疫的關系。

3.2.1 抗菌肽與天然免疫 補體(Complement,C)是血漿蛋白的正常組成成分，存在于人與動物血漿中一組無活性的分泌蛋白和膜結合蛋白前體。激活補體系統過程中，會產生多種活性分子參與機體的抗感染免疫，調節細胞與體液免疫效應，介導炎癥反應。血清中補體C3、C4含量反映機體的免疫水平。王靜(2007年)研究發現，飼喂抗菌肽粗提的肉雞，21日齡血清補體 C3、C4含量要明顯高于對照組[12]。本試驗使用CBAP飼喂豬群30 d后發現，在試驗第10天時，CBAP組豬的血清補體C3、C4含量逐步要高于對照組，在第20～30天，試驗組的C3、C4含量要顯著高于對照組，這說明抗菌肽對補體系統有很好的促進作用，這與王靜的研究結果相一致。γ-干擾素由活化T細胞和自然殺傷細胞產生，具有較強的免疫調節功能。它可以調節T、B淋巴細胞的功能，小劑量時起促進作用，大劑量卻表現為抑制。本試驗對飼喂CBAP的豬群血清進行γ-干擾素檢查發現，對照組相比，飼喂CBAP組在第30天γ-干擾素明顯高于對照組。脾淋巴細胞轉化率的高低可以反映機體的細胞與體液免疫水平，本次試驗飼喂30 d CBAP后，各組取4頭豬的脾臟，分離淋巴細胞，用ConA作為T淋巴細胞有絲分裂原，用LPS作為B淋巴細胞有絲分裂原，刺激測定細胞轉化率結果發現，對照組相比，CBAP組的對T、B淋巴細胞轉化率均極顯著地提高(P<0.01)。說明CBAP可以有效緩解動物的免疫抑制。

3.2.2 抗菌肽與體液免疫 AMPs不但可以調節先天性免疫，而且對適應性免疫也有很好的促進作用。將卵清蛋白(OVA)與α-防御素HNP1-3聯合應用于小鼠，與單獨使用OVA相比，聯合使用可以增加OVA的IgG抗體水平[13]。蜂毒肽(Melittin)是一種24個氨基酸的多肽，存在于蜂毒中，具有很強的疫苗佐劑活性。使用這種肽結合破傷風類毒素(TT)或白喉類毒素(DT)抗原鼻腔免疫小鼠，血清抗TT和抗DT IgG明顯高于單獨接種抗原小鼠[14]。這可能是由于AMPs通過誘導共刺激分子促進IDCs的成熟，在APC與抗原接觸時來調節淋巴細胞反應，改變細胞因子的表達，導致抗原攝取增加。從而促進更有效的抗原提呈及后續更強大的T細胞活化。但要考慮抗菌肽自身的免疫原性，因此建議使用短肽(<15氨基酸)作為免疫佐劑。本次試驗發現CBAP對豬瘟抗體效果不顯著，這可能是由于豬瘟是弱毒疫苗，有囊膜，CBAP對其也有一定的殺滅或者抑制體內增殖作用。因此影響了其抗體的產生，但CBAP也對免疫有一定促進作用，最后結果表現出差異不顯著。本試驗中豬偽狂犬第2次免疫采用的是滅活疫苗，CBAP對其抗體的產生有明顯的促進作用。口蹄疫O、A抗體與偽狂犬一致，在抗體效價上，CBAP組要明顯優于對照組(P<0.05)。根據本次試驗發現，CBAP對弱毒苗效果不是很理想，但對滅活苗的效果比較好。