野生型p53誘導的磷酸酶1在細胞穩態調節中作用的研究進展

閆峰，羅玉敏，朱玲玲，范明2,3,*

(1.首都醫科大學宣武醫院腦血管病研究室，北京 100052； 2.首都醫科大學腦重大疾病研究中心，北京 100069；3.北京腦重大疾病研究院，北京 100069； 4.中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，北京 100029)

野生型p53誘導的磷酸酶1(Wip1)是蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase type 2C，PP2C)激酶家族中的一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，其由PPM1D基因編碼，位于染色體的17q22-23位，在干細胞、中性粒細胞、骨髓來源的巨噬細胞和T淋巴細胞廣泛表達。與眾多的磷酸酶通過磷酸化或者去磷酸化發揮催化作用不同，目前的研究還沒有報道Wip1的活性可以通過翻譯后的修飾進行調節，大家公認的對于Wip1的調節方式主要是通過其表達量的變化而實現的[1]。

顧名思義，對于Wip1最早的研究是發現其在機體遭受電離輻射后，可以作為p53的一個靶基因參與損傷應答，隨著研究的深入以及研究方向的擴大，研究人員發現應激狀態下Wip1還可以被多種刺激誘導表達，包括電離輻射、紫外線照射、過氧化氫、炎癥因子等刺激可以使Wip1可以直接綁定到多種關鍵的信號分子上，使其靶分子去磷酸化從而發揮抗凋亡、細胞周期停滯和DNA損傷修復的作用，對細胞增殖、細胞周期、衰老、應激反應細胞的凋亡和自噬進行關鍵的調節；而在正常狀態下，Wip1也起著調節DNA損傷修復的作用，使細胞可以正常的新陳代謝，使機體維持在一個正常的平衡狀態下。而且在眾多疾病模型的研究中發現了Wip1在DNA損傷應答、腫瘤增殖調節以及免疫反應中都具有非常的重要作用[2-3]。目前報道的Wip1下游靶基因主要包括p53、ATM、p38MAPK、NF-κB、mTOR等，通常我們認為Wip1作為負反饋環路中的一個重要分子參與到細胞穩態的調節中。Wip1被誘導后負向調節DNA損傷相關信號通路，降低p53的活性，使很多DNA損傷修復的相關蛋白表達增加，抑制細胞凋亡的發生[4]。在本篇綜述中，將主要對其在腫瘤發生及炎癥反應中的調控作用進行綜述。

1 Wip1在抗凋亡中的作用

腫瘤作為威脅人類健康的一類主要疾病，對其研究也愈發深入。在近些年中的研究中發現在多種人類的腫瘤細胞中都出現了Wip1過表達的現象，包括直結腸癌、乳腺癌、胃癌等[5-7]。細胞的凋亡在維持DNA正常復制和DNA正常傳遞給子代的過程中發揮著重要的作用，它可以避免將發生突變的、有害的DNA傳遞給子代。而在腫瘤的形成過程中，往往會出現細胞凋亡功能的異常，進而促進了腫瘤的增殖。p53作為一個重要的調控凋亡的分子，已有大量研究證明其在多種腫瘤細胞中都發生了突變。而Wip1作為p53的負反饋調節凋亡過程的典型分子，他可以通過直接與p53相互作用，使其去磷酸化，進而通過影響上下游相關蛋白的表達起到抑制凋亡，促進細胞存活的作用。已有多篇文獻報道了Wip1通過影響p53的功能在腫瘤細胞存活中發揮重要作用[8-9]。Yang等[10]在臨床工作中發現了在非小細胞肺癌的發生過程中，Wip1調節的p38MAPK/p53/p16通路在其中發揮了重要作用。在人類常見的腫瘤癌細胞系SKOV3中使用Wip1的siRNA可以明顯的增加SKOV3細胞的凋亡相關蛋白表達和p38MAPK的磷酸化，有可能成為人類卵巢癌潛在的治療途徑[11]等。與大多數的研究結果都顯示p53可以正向調控Wip1的表達不同，有研究顯示p53/Wip1/miR-16三者之間存在一個環路，p53可以通過誘導miR16的表達從而抑制Wip1的表達，影響細胞的衰老和凋亡[12]。這個現象既可以說明通過增加miR16的水平而抑制Wip1有可能在抑制腫瘤組織的再生過程中會發揮重要作用，但是同時也說明對于Wip1表達的調控要更加精細的進行。基因表達分析結果顯示，包括MMp-9和CXCR4等轉移基因在高表達Wip1的成神經管細胞瘤中的表達出現了上調，促進了癌細胞的增殖和侵襲。同時有研究發現，Wip1單獨過表達或者與SHH信號通路共同被激活時可以明顯的促進成神經管纖維瘤的存活和增殖，這說明Wip1與SHH信號通路間存在著重要的串聯通路，此通路可以作為抑制Wip1表達，治療成神經管細胞瘤的一個可能的方案[13]。

2 Wip1在DNA損傷修復及細胞周期中的作用

眾所周知，細胞生命活動的絕大部分時間是處在細胞周期的間期，這個時期是細胞合成DNA和各種酶類的重要時期。如果DNA發生損傷可以迅速阻止細胞周期進程并促進細胞中的DNA修復。有文獻報道顯示Wip1抑制后可以顯著抑制細胞周期，促進G2期停滯期間受損DNA的修復[14]。在另一項癌癥候選藥物Mdm2拮抗劑的篩選研究中發現抑制Wip1可以影響Mdm2的功能增加細胞的衰老和細胞在G2/M期的積累[15]。以上的研究說明了Wip1在細胞周期調控中的重要作用，也是Wip1影響腫瘤發生的理論基礎之一。同時有研究發現在非應激狀態下，Wip1介導的細胞周期停滯現象可以增加有絲分裂的成功率，避免細胞因有絲分裂失敗造成的死亡，這也為腫瘤細胞逃避有絲分裂檢查點創造了條件，客觀上促進了腫瘤細胞的增殖[16]。鑒于Wip1在正常細胞以及應激后的重要作用，在合適的時間點對其進行調控顯得尤為重要。韓國的研究人員發現，正常細胞有絲分裂的末期APC/Ccdh1可以通過影響Wip1穩定性來調節細胞周期，這對于維持細胞正常的有絲分裂具有重要的意義[17]。即使是在正常的情況下，細胞也是在不斷地經受著DNA損傷的挑戰，細胞通過復雜的DNA損傷修復機制來不斷的修復損傷，從而保證遺傳信息的完整和正確。蛋白質的磷酸化在DNA損傷修復復雜的機制中充當著關鍵的角色。γH2AX是DNA雙鏈損傷和DDR信號通路的一個標簽，在DNA損傷的修復過程中發揮了重要作用，它可以招募Mdc1，Rad51等參與損傷修復的分子到DNA雙鏈的損傷處共同參與修復過程。免疫熒光染色發現Wip1可以與γH2AX在染色質共定位，同時生化方面的研究發現Wip1可以使γH2AX去磷酸化從而降低其水平，減少其對于DNA損傷修復元件的募集。在應激狀態下，Wip1的缺失會造成γH2AX水平的增加，而過表達Wip1可以降低其水平，且這種影響是以ATM依賴的方式進行的。后續的研究發現Wip1對于γH2AX的作用不止是影響DNA損傷修復元件的募集，并且可以阻止細胞進入G2/M期細胞周期檢查點。在腫瘤發展中，γH2AX也發揮著關鍵作用，更說明了Wip1作用的關鍵[18]。而在Macurek等[19]的研究中使用先進的實驗技術和嚴格的實驗流程細致的觀察了Wip1在細胞周期中的動態變化，他們證明了Wip1在細胞周期的G1和S期處在較高的水平，而在有絲分裂期處在較低的水平。其在有絲分裂末期是通過APC/C和其啟動子Cdc20控制Wip1泛素依賴的蛋白酶體降解途徑降低了Wip1的表達水平。

干細胞作為組織損傷后修復過程中新生細胞的重要來源，越來越受到研究人員的重視，體外培養的干細胞可能作為多種疾病新的治療手段，使之前無法治愈或預后不良的疾病被攻克成為可能，適度的激活干細胞可以補充受損組織，恢復組織功能；而過度的激活干細胞則有可能帶來腫瘤的風險，因此對于其狀態的控制至關重要。已經有研究發現在腸癌中Wip1高表達在腸干細胞中，Wip1可能通過抑制干細胞中p53的功能而啟動了腸癌的發生[20]。而在對神經干細胞的研究中發現，在Wip1缺失的小鼠腦組織的本應該聚集大量神經干細胞的SVZ區出現明顯的神經干細胞減少[21]，這有可能會對神經元損傷后的修復造成一定的影響。有研究發現在造血干細胞中Wip1具有較高的表達水平，但是其表達量隨著年齡的增加而減少。與在其他細胞中不同的是，Wip1在造血干細胞中發揮作用一方面通過p53介導，另一方面可以獨立于p53通路，通過mTORC1介導的造血干細胞增殖[22]，該實驗部分揭示了干細胞衰老的機制。MdmX是一個p53的負反饋調節因子，上調MdmX可以啟動負反饋回路，其可以與Mdm2形成復合體，使p53泛素化增加，降低其蛋白水平。由于其對于p53的負反饋作用，MdmX可以在應激狀態下調對于DNA損傷的應答，其有可能與Wip1有協同作用，或者二者之間存在著某種聯系。研究結果顯示Wip1一方面可以直接去磷酸化MdmX的403絲氨酸位點，另一方面以間接方式抑制MdmX342和376位絲氨酸的磷酸化，提高MdmX的水平；過表達Wip1可以減低pS403-MdmX的水平，反過來與Wip1正常組相比，Wip1敲除可以降低MdmX的水平。由此證明了Wip1與MdmX協同作用，降低了p53的功能，促進腫瘤組織的生長[23]。由此可見對于Wip1表達的調控可能會影響到疾病的最終走向。

3 Wip1對細胞炎性反應的調節

近期的多項研究結果顯示，Wip1對炎癥的調節起著關鍵作用。對于Wip1在炎癥中作用的研究多數實驗直接使用LPS刺激后觀察模型反應。多項研究已經證實了在炎癥反應中具有重要作用的分子—NF-κB是Wip1的一個靶分子。在IL-1或者TNF-α刺激下，過表達或者敲低Wip1可以減少或者增加NF-κB的活性。進一步的研究結果顯示Wip1調節NF-κB的活性是通過磷酸化其536位的絲氨酸而實現的，與其抑制分子I-κBα無關；并且不依賴于p38MAPK通路，在使用p38MAPK的抑制劑SB202190后并不能挽救由于Wip1缺失造成的p65的536位絲氨酸水平的升高[24]。而在對噬中性粒細胞的研究中發現，Wip1通過p38MAPK-STAT1通路影響骨髓前體細胞向嗜中性粒細胞的成熟分化，并且此作用是p53非依賴性的[25]，這說明Wip1對于免疫細胞的調節在不同的細胞或者不同的發育階段所介導的通路是不同的。在一項使用Wip1敲除的動物制作腸缺血再灌注模型的研究中發現相比較于野生動物，Wip1敲除的動物會表現出更為嚴重的腸缺血再灌注損傷。進一步的研究發現，Wip1的敲除導致腸缺血再灌注后中性粒細胞浸潤增加，并且趨化因子CXCL-1、CXCL-2、炎癥因子TNF-α、IL-17等促炎物質表達明顯增加，并且他們發現缺血再灌注損傷的加重是由于Wip1敲除后中性粒細胞分泌更多的IL-17所引起的。在同時進行的一項臨床實驗中發現，在活躍期的炎性腸病病人外周血液和腸固有上皮細胞中的Wip1較健康人群均明顯下降，平行進行的DSS誘導的小鼠腸炎模型中也得到了相同的結果，而且Wip1敲除的小鼠炎性損傷更加嚴重[26]，這都可以說明Wip1在腸炎中的重要的抑制作用。

圖1 Wip1在調節細胞穩態作用中的靶點及信號通路Figure 1 Targets and signaling pathways of Wip1 in regulating cell homeostasis

越來越多的研究表明，炎癥在多種中樞神經系統疾病中起著關鍵的作用，例如老年癡呆、外傷性腦損傷、高原腦水腫等。有學者觀察了Wip1在中樞神經系統炎癥反應中的作用。在2013年，Tan等[27]使用尾靜脈注射LPS的方法誘導大鼠全身炎癥反應后發現腦組織中Wip1的表達水平顯著升高，同時他們還觀察到星形膠質細胞被明顯激活，二者之間存在著一定的聯系；而在體外實驗中使用siRNA敲低原代培養的星形膠質細胞中的Wip1后可以觀察到TNF-α表達水平顯著增加。進一步的研究結果顯示，Wip1的缺失加重了LPS刺激后血腦屏障的破壞，緊密連接相關蛋白表達下降，除TNF-α外，IL-1β、IL-12和IL-6等促炎因子表達水平明顯升高，Sonic hedgehog(SHH)信號通路被Wip1的過表達或者低表達所影響，因此作者認為Wip1缺失導致的促炎因子的升高和SHH信號通路的變化是血腦屏障通透性增加的主要原因[28]。在從視網膜細胞誘導分化的星形膠質細胞離體實驗中發現，使用LPS刺激后，Wip1和NF-κB的表達出現了明顯的上調并且共同定位在星形膠質細胞中，使用Wip1 siRNA預處理可以增加LPS刺激后NF-κB P65的入核，并且促炎因子釋放；而使用抑制劑抑制NF-κB可以明顯的降低Wip1在原代星形膠質細胞中的轉錄。在視神經損傷的動物模型中也發現了同樣的現象。視神經損傷后星形膠質細胞中的Wip1的表達明顯增加，并且NF-κB p65亞基的磷酸化顯著升高，炎癥因子釋放增多[29]。聯系前面的實驗NF-κB調節Wip1的表達，說明Wip1與NF-κB之間可能同樣存在一個負反饋的環路從而相互影響[30]。本課題組在前期研究中也發現在將腹腔注射LPS的小鼠放置在模擬高原低氧的極端環境中，Wip1的缺失會導致腦組織和外周循環中的炎癥因子較野生動物明顯升高，并且通過免疫組化的方法發現腦組織中定居的免疫分子小膠質細胞被大量激活，加重了認知和行為功能的損傷，說明Wip1在高原低氧炎癥誘導的腦損傷中的重要作用[31]。但之前大量的研究均是使用LPS刺激機體或者細胞所誘導的炎癥反應，在病理生理狀態下的炎癥反應發生機制與LPS刺激后的炎癥反應發生機制不完全相同，因此Wip1對于現實病理生理狀態下炎癥反應的調節還有待進一步研究。

4 總結

雖然近年來對于Wip1在應激后的研究取得了一定的進展，其可以被多種應激刺激誘導表達，并且多種信號通路參與到對其表達的調控中(圖1)，但是仍有很多方面需要進行深入的研究。Wip1在不同通路中的調節作用與其時空表達具有密切關系。例如Wip1在正常組織中可以調節細胞的穩態，在一定范圍內促進細胞的增殖，但其過表達后會表現出明顯致瘤的傾向；另一方面Wip1缺失后導致機體炎癥反應的增加，而目前對于炎癥反應的研究顯示其與機體老化進程有著密切的聯系。如何調整Wip1的表達，使其有益的功能最大化，又可以避免腫瘤的形成還存在著巨大的未知。并且目前的研究結果顯示Wip1與p53，p38MAPK和NF-κB等分子均構成負反饋環路，其水平的變化會影響多個環路相關蛋白的表達，而受到影響的蛋白發生變化后還會再次作用于Wip1，這種負反饋環路的存在強調了Wip1對于細胞穩態的調節作用，但也對希望將其功能發揮到最大構成了相當大的挑戰。研究發現ERα被可以直接綁定到Wip1的啟動子區域，從而調節Wip1的表達，在腫瘤中的生長過程中發揮作用，但是研究人員發現單純過表達Wip1并不會導致腫瘤的發生[32]。因此Wip1可能本身并不是一種直接的致癌基因，而是通過它在多個目標分子上的功能為腫瘤的發展提供了便利。此外現階段對于Wip1酶活性的研究還有待加強。其本質作為一種酶類，表達量和酶活性的變化均可能對其在病理生理過程中的作用產生巨大的影響。因此對Wip1表達水平及活性的嚴格控制，對于其在細胞中發揮重要的功能至關重要。一旦解決好這兩方面的調控，將Wip1促進細胞增殖的功能發揮出來，使之成為一個有效的藥物靶點，可以使目前治療困難的多種疾病獲得巨大的進展。