兔源多殺巴斯德桿菌基因分型研究

黃樹武，王 靜，潘金春，陳梅玲，張 鈺，閔凡貴

(廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

多殺巴斯德桿菌(Pasteurellamultocida，P.multocida)是一種重要的人獸共患病原菌，其感染宿主十分廣泛，能感染多種家禽、家畜、野生動物和人等，其中可引起兔鼻炎、肺炎、中耳炎和出血性敗血癥等疾病，導致兔急性或亞急性死亡，嚴重威脅兔的生命健康[1-2]。

細菌分型是了解細菌性傳染病流行特征的重要技術之一，對研究感染源、感染途徑以及地方性菌株和流行菌株之間的鑒別有著非常重要的作用[3]。隨著分子生物學技術的發展，相較于生化分型、血清學分型、噬菌體分型等傳統分型技術，基因分型技術以其快速、簡便、靈敏、靈活等特點日漸受到青睞。目前，臨床上用于多殺巴斯德桿菌診斷的基因分型方法主要包括基于莢膜編碼區的多重PCR方法和多位點序列分型法(multi-locus sequence typing, MLST)[4-5]。近年來，有意大利[6]、西班牙[7]和捷克共和國[8]等國家對兔源P.multocida進行基因分型的報道，而我國僅有少量關于禽源、豬源等多殺巴斯德桿菌基因分型的研究[9-11]。

本研究對實驗室分離的兔源P.multocida在生化表型特征的基礎上，運用分子分型方法分析分離菌株的基因型特征和菌株間的同源性，揭示菌株間基因多態性和群體遺傳結構，獲得廣東地區實驗兔感染P.multocida分型數據，了解廣東地區實驗兔感染P.multocida的流行特點，有利于更好地指導廣東本地實驗動物質量控制與監測。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗菌株來源于2000年至2018年期間廣東地區不同實驗動物設施，從普通級急性發病死亡的新西蘭兔呼吸道分離到的14株多殺巴斯德桿菌。實驗操作在實驗動物使用設施[SYXK(粵)2016-0122]進行，所有操作遵循動物福利和倫理要求，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。多殺巴斯德桿菌陽性對照菌株(ATCC43137)來自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所饋贈。

1.2 主要試劑與儀器

血瓊脂平板(批號：ZBAp-180715D)和DHL平板(批號：H1038Y)購自廣東環凱微生物科技有限公司；三糖鐵(批號：180828)、半固體瓊脂(批號：170817)和無菌生理鹽水(批號：H0993Y)購自北京陸橋技術股份有限公司；糖(苷或鹽)類等微量生化管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；觸酶試劑盒(批號：1005440900)、氧化酶試劑盒(批號：19540501)、ID 32E(批號：1006416960)和API 20NE(批號：1006405070)生化試劑盒購自法國生物梅里埃股份有限公司；革蘭染色液試劑盒(批號：418082)購自珠海貝索生物科技有限公司；PCR試劑包括細菌基因組DNA提取試劑盒(批號：R6717)、DNA純化回收試劑盒(批號：Q5601)購自天根生化科技有限公司；Premix Taq(批號：A4701 A)、DL-2000 Marker(批號：A1801 A)、瓊脂糖(批號：172175)等購自寶生物工程(大連)有限公司，各種試劑均在有限期內使用。

生物安全柜(德國，Biometra型)；生化培養箱(寧波江南儀器廠，SPX-288型)；生物顯微鏡(德國，Leica DM500型)；ATB梅里埃鑒定儀(法國，ATB NEW型)；PCR超凈工作臺(上海市金鵬科技有限公司，BHC-1300II A/B3型)；PCR儀(德國，Biometra)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，TG16-W型)；電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-6C型)；全自動凝膠成像系統(美國，Bio-Rad PowerPac Basic 164-5050型)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離培養與生化鑒定

依據實驗動物國家標準GB/T 14926.5-2001實驗動物多殺巴斯德桿菌檢測方法對臨床分離的可疑多殺巴斯德桿菌進行系統生化鑒定分析。同時使用法國梅里埃生化鑒定條ID 32E和API 20 NE進行生化鑒定，并按照試劑盒說明書進行鑒定結果的判定。

1.3.2 分子分型分析

(1)菌株DNA提取

按照試劑盒說明書，將所有臨床分離菌株使用細菌基因組DNA提取試劑盒進行基因提取，提取的核酸作為分子分型的DNA模板。

(2)莢膜分型

按照Townsend等[12]建立的莢膜多重PCR方法對分離菌株進行kmt基因定種鑒定，再使用莢膜特異基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD設計引物進行A、B、D、E和F分型，分型引物序列(見表1)。反應體系為2 μL基因組DNA加入2 μL引物(10 μmol/L), 25 μL Premix Ex Taq，加滅菌蒸餾水到反應總體系為50 μL。反應條件按95℃預變性12 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，反應進行35個循環，最后72℃延伸7 min。最后吸取10 μL PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

(3)MLST分型

針對多殺巴斯德桿菌adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh、pgi7個特異基因序列設計引物，分型引物序列及反應條件(見表1)，對臨床分離菌株進行PCR擴增和測序，測序后經過組裝分析確認的序列提交MLST數據庫(http://pubmlst.org/)進行比對，得出每個菌株各位點的等位基因數目，然后進行等位基因序列類型(sequence type, ST)鑒定，使用MLST數據庫在線分析軟件進行聚類分析，構建系統發育樹，分析其遺傳進化關系。

表1 多殺巴斯德桿菌株基因分型引物

2 結果

2.1 分離培養與生化鑒定結果

所有分離菌株在血瓊脂平板上，于37℃生化培養箱中培養18～24 h后形成1 mm左右，光滑露滴樣或灰白色、不溶血的菌落。在DHL瓊脂平板上不生長。革蘭氏染色為陰性小桿菌，兩端鈍圓并濃染。生化反應為觸酶試驗陽性，氧化酶陽性，三糖鐵試驗為斜面及底層產酸不產氣、乙酸鉛紙條法顯示硫化氫陽性，半固體動力陰性，乳糖陽性，尿素酶陰性，靛基質試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，枸櫞酸鹽利用試驗陰性，賴氨酸脫羧酶為陰性，不液化明膠；而鳥氨酸脫羧酶結果為陽性其菌株所占比例為79%(11/14)，葡萄糖陽性比例為57%(8/14)，蔗糖陽性比例為79%(11/14)，麥芽糖陽性比例為14%(2/14)。

使用法國梅里埃生化鑒定條ID 32E和API 20 NE都能鑒定所有臨床分離菌株為多殺巴斯德桿菌，鑒定ID值都為99.3%以上，鑒定評價為好的鑒定。

2.2 分子分型結果

2.2.1 莢膜分型結果

將所有分離菌株進行kmt基因定種鑒定，均出現約460 bp的目的條帶(見圖1A)。使用莢膜分型多重PCR方法擴增后產物進行瓊脂糖凝膠電泳，出現約1044 bp與760 bp兩種目的條帶(見圖1B)，據此將菌株分為A型與B型兩種莢膜血清型，A型為主，占比71.4%(10/14)。

2.2.2 MLST分型結果

將所有分離菌株經7個管家基因的擴增和測序，測序后序列提交MLST數據庫上進行比對分析，結果顯示有ST12、ST35型、ST72型、ST73型、ST76型、ST77型共6種ST型，并且首次發現了新ST76型，ST77型(見表2)。然后對分離菌株進行聚類進化分析，構建廣東兔源多殺巴斯德菌株遺傳進化樹與最小生成樹(見圖2)；并將本研究菌株與MLST數據庫中多個國家兔源多殺巴斯德菌株進行比對進化分析，結果表明，本研究中兔源多殺巴斯德桿菌與意大利、西班牙、捷克共和國、丹麥等國家的菌株存在復雜的遺傳交叉進化關系(見圖3)。

3 討論

據多個國家流行病學調查資料顯示，多殺巴斯德桿菌感染是一種全球性的現象[6-8,11, 13-15]。鑒于多殺巴斯德桿菌感染宿主的多樣性與所致疾病的危害性，臨床上針對分離菌株開展分型鑒定，對于了解其感染和致病規律，建立細菌流行病學資料具有重要的意義。

本研究在分離菌株培養特性與生理生化特性基礎上，應用分子分型方法對其進行分型研究。在菌株生化反應特征上，臨床分離菌株大部分生化反應相同，但個別生化反應結果與實驗動物現行國家標準不一致。國內亦有文獻報道多殺巴斯德的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和鳥氨酸脫羧酶等生化反應結果陰陽性不一[16-17]。倘若完全按照實驗動物國家標準進行檢測，可能會導致誤判漏檢。考慮通過PCR方法輔助診斷，或者借助商品化生化鑒定試劑盒方法驗證結果的準確性，作為一種有益補充手段。

注：A：kmt 基因定種鑒定, M: DL2000 DNA Marker; 1～14號: 樣本; 15: 多殺巴斯德桿菌株(ATCC43137)陽性對照; 16: 空白對照。B：莢膜分型多重PCR方法鑒定, M: DL2000 DNA Marker; 17～30: 樣本; 31: 多殺巴斯德桿菌株(ATCC43137)陽性對照; 32: 空白對照。圖1 廣東地區兔源多殺巴斯德桿菌莢膜分型結果電泳圖Note. A: Identification of kmt gene species. M, DL2000 DNA Marker; 1～14, Sample; 15, Pasteurella multocida strain (ATCC43137) positive control; 16, Blank control. B: Capsule typing multiplex PCR method was identified. M, DL2000 DNA Marker; 17～30, Sample; 31, Pasteurella multocida strain (ATCC43137) positive control; 32, Blank control.Figure 1 Electrogram of capsule typing of Pasteurella multocida from rabbits in Guangdong

注：“+”表示陽性。

Note. “+”: positive.

注：A：進化樹圓圈從外到內為菌株編號，分離時間，ST型，莢膜型；B：圓圈內數字代表ST型。圖2 廣東地區兔源多殺巴斯德桿菌遺傳進化關系與最小生成樹Note. A, The sequence of evolutionary tree circle is strain numbers, isolation time, MLST genotypes, Capsular genotypes from outside to inside. B, The number in the circle represents the MLST genotypes.Figure 2 Genetic evolution relationship and minimal spanning tree of pasteurella multocida isolates from rabbits in Guangdong

圖3 廣東地區兔源多殺巴斯德桿菌與多個國家菌株遺傳進化分析Figure 3 Genetic and evolutionary relationship between Pasteurella multocida isolated from rabbit and strains from several countries in Guangdong

多殺巴斯德桿菌根據莢膜抗原可分為5種血清型，分別為A、B、D、E和F，不同血清型與其宿主和疾病之間有一定相關性，血清A和F與呼吸道疾病和家禽霍亂有關，血清B和E與出血性敗血癥有關，而D血清通常與豬萎縮性鼻炎相關[1,11,18]。目前已報道兔源P.multocida有A、D和F型三種莢膜血清型[6-8,11]。本研究中莢膜分型結果顯示廣東地區兔源P.multocida主要為A型，也發現兔源P.multocida莢膜血清B型。這與我國不同地區雞，鴨，豬等來源的P.multocida其莢膜優勢血清型為A型一致[9-11,17]。病原菌株分離至兔呼吸道，通過呼吸道傳播感染，從而導致兔急性或亞急性死亡，應引起實驗動物生產者與使用者的關注。

本研究將菌株MLST分型結果顯示，廣東地區兔源多殺巴斯德桿菌存在ST12、ST35、ST72、ST73、ST76、ST77共6種ST型，并且首次發現了新ST76(Adk8-aroA4-deoD5-gdhA3-g6pd5-Mdh7-Pgi5)型和ST77(Adk18-aroA21-deoD20-gdhA18-g6pd19-Mdh18-Pgi18)型，已提交MLST數據庫確認并收錄。此研究揭示了廣東地區兔源多殺巴斯德桿菌菌株間的基因多態性，且動物設施A，D，E的兔子都存在ST73型的菌株污染，構成一個遺傳群體結構，其他的ST型菌株感染存在散播性。另外，實驗動物設施F從2016年分離到ST12型菌株，2018年6月份再次分離到同種基因型菌株，后8月份分離到ST77型菌株，考慮此時有外來變異菌株污染設施。通過對廣東地區菌株的進化分析，ST12型菌株與ST35型、ST73型、ST76型和ST77型存在一定的進化同源關系，而與ST72型菌株親緣關系相對較遠，尤其新發現的ST76型和ST77型可由ST12型菌株各進化出一個分支而來。本研究將分型結果與MLST數據庫中不同時間地理區域分離菌株進行橫向與縱向比對分析。不同基因型的菌株流行存在地理區域性和偏向性，意大利以ST9、ST50和ST74為主，西班牙為ST50，捷克共和國為ST9，而本研究的兔源P.multocida以ST12和ST73為主；同源性比對分析發現本研究菌株與意大利、西班牙、捷克共和國等國家的菌株存在復雜的遺傳交叉進化關系。

實驗動物國家標準中普通級兔不要求排除多殺巴斯德桿菌，導致實驗動物生產機構放松了對該菌的控制，課題組曾對廣東地區普通級兔感染多殺巴斯德桿菌的攜帶情況進行調查，顯示陽性率為2.5%(4/160)(數據暫未發表)，鑒于多殺巴斯德桿菌對兔的危害性，且菌株主要通過呼吸道途徑傳播感染，在實驗兔的生產繁育過程中需要高度重視。