過敏性疾病小鼠動物模型建立及表型變化的研究進展

白夢天，胡竹林*

(1.昆明醫科大學第四附屬醫院，眼科，昆明 650032； 2.云南省眼科研究所，昆明 650032；3.云南省第二人民醫院，眼科，昆明 650032； 4.姚克專家工作站，昆明 650032)

過敏性疾病在發達國家、部分發展中國家及地區已具有較高的發病率，這與當地經濟因素、環境因素密切相關。不同個體致敏后，其抗體對于抗原的敏感性存在差異，且不同個體之間可能存在不同的臨床表現，使得過敏性疾病的的臨床表現及治療存在較大差異[1]。為了更有效方便地研究過敏性疾病，過敏性疾病小鼠模型已經被廣泛運用，并且取得了豐碩的成果。同時，研究者正嘗試將成果服務于臨床[2]。盡管不同的過敏性疾病發病機制不同，但構建過敏性小鼠模型時卻常采用相同的方式，即抗原系統性致敏，其后進行局部激發。而常用的抗原包括卵清蛋白(ovalbumin, OVA)、豚草花粉(ragweed pollen, RW)、屋塵螨(house dust mites，HDM)等。致敏小鼠以發生I型和IV型過敏反應為主。包括嗜酸性粒細胞浸潤、肥大細胞脫顆粒、抗原特異性IgE的產生，Th細胞的活化、Th1/Th2失衡等[3]。本文將對過敏性結膜炎、過敏性哮喘、特應性接觸性皮炎、食物性過敏的小鼠動物模型構建以及表型變化進行綜述。

1 過敏性結膜炎

據統計，過敏性結膜炎全球患病率約10%～30%，但真實患病率可能高于當前統計結果，可能的原因在于其缺乏特征性臨床體征且部分患者未及時就診。過敏性結膜炎作為一種免疫系統疾病，其與過敏性哮喘、食物性過敏具有相似的免疫學機制[4]。

過敏性結膜炎動物模型的建立首先需全身致敏，而后進行眼部抗原激發(表1)。目前認為，特異性IgE介導的I型超敏反應，特異性T細胞介導的IV型超敏反應與過敏性結膜炎具有密切關聯。當機體處于致敏狀態下，變應原與眼表肥大細胞膜FcεRI上的IgE結合，啟動早期相反應(early phase reaction，EPR)，引起肥大細胞脫顆粒，釋放一系列細胞因子，如嗜酸性粒細胞趨化因子(eosinophilic chemotactic factor)、組胺(histamine)以及白三烯(leukotrienes)等[10]。當進入晚期相反應(later phase reaction，LPR)時，則可見大量嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、T淋巴細胞浸潤，并釋放細胞因子、趨化因子，引起角結膜組織的炎性損傷。

樹突狀細胞(Dendritic cell，DCs)可將變應原收集并運輸至淋巴結，激活T細胞，造成Th1/Th2漂移，Th2細胞優勢表達。Th2細胞產生的IL-4、IL-5、IL-6、IL-13可促進IgE的產生，并促進IgE與肥大細胞膜FcεRI的結合，引起炎癥損傷[11]。2000年IL-37被首次提出[12]，IL-37屬于IL-1基因家族成員，IL-1家族包含7個促炎因子(IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、 IL-36γ)，4個抗炎因子(IL-1R 拮抗因子、IL-36R拮抗因子、IL-37、IL-38)[13]。IL-37能夠與IL-18競爭性結合IL-18Rα，招募孤兒受體IL-1R8。IL-1R8能夠抑制先天性和獲得性免疫，并且上調抗炎相關信號通路，如AMPK、JAK/STAT，下調促炎相關通路如NF-kB、NLR3等[14]。由于小鼠體內并不能檢測到IL-37，因此無法使用基因敲除技術構建IL-37缺陷小鼠，但隨著轉基因技術的不斷發展，IL-37轉基因(IL-37 -transgenic, IL37-tg)小鼠已經成為過敏性疾病中研究IL-37常用的動物模型[15]。此外，經重組IL-37處理的野生型(wild-type, WT)小鼠同樣能夠發揮抗免疫作用[16]。當前，IL-37已經成為多種過敏性疾病研究的新熱點。然而，IL-37在過敏性結膜炎的研究中還鮮有報道。

表 1 過敏性結膜炎小鼠造模方法及表型變化

注：RW：豚草花粉； OVA：卵清蛋白；SWR：短豚草花粉。

Note. RW, ragweed pollen. OVA: Ovalbumin. SWR:short ragweed pollen.

2 過敏性哮喘

由于小鼠致敏程度高、繁殖能力強且適合大規模飼養，因此成為該類疾病常用的模型動物。但有研究者[17]認為，過敏性哮喘小鼠不會自發地表現出氣道高反應性(airway hyperresponsiveness，AHR)，需要在模型成功建立的基礎上使用支氣管收縮劑，其原因為小鼠氣道直徑相對較大，不易出現可逆性氣流阻塞，并不能直接反應氣道受阻情況，但仍能觀察到嗜酸性粒細胞浸潤增加，CD4+細胞表達增高，特異性IgE表達增高等，Th1/Th2失衡等現象。

過敏性哮喘小鼠模型的建立分為致敏階段和效應階段，在致敏階段需全身致敏，效應階段則多采用霧化吸入方法激活效應細胞，從而引起過敏反應(表2)。在EPR階段，IgE激活肥大細胞，使支氣管平滑肌收縮，黏蛋白分泌增加以及炎性因子增加。在LPR階段，隨著炎性細胞遷移至肺組織和氣道上皮細胞，引起氣道平滑肌肥大、氣道上皮脫落、杯狀細胞化生以及上皮纖維化[23]。在過敏性哮喘小鼠模型中，IL-4主要作用于B淋巴細胞，增強肥大細胞、嗜堿性粒細胞中IgE受體的親和力，從而促進抗原特異性IgE的產生。IL-5主要激活和招募骨髓組織中嗜酸性粒細胞。IL-13主要引起氣道上皮細胞高反應性、杯狀細胞化生以及激活巨噬細胞等[24]。

IL-37廣泛分布在人體的各個器官和組織中，如肺、淋巴結、胸腺等，此外，人和小鼠的上皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞有IL-18Rα。 給予過敏性哮喘小鼠rhIL-37滴鼻，在其肺泡灌洗液中發現Th2相關細胞因子顯著下降，同時出現哮喘癥狀的明顯改善[25]。而敲除IL-18Rα后，則無法觀察到IL-37的抗炎作用[26]。提示IL-18Rα對于IL-37效應的發揮具有重要。IL-37發揮抗過敏性哮喘作用的機制也是研究者目前關注的熱點。有研究認為在過敏性哮喘動物模型中，IL-37通過抑制IL-4/IL-6誘導的CCL1的產生而發揮作用[27]。Robuffo等[28]認為，IL-37通過抑制髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，進而抑制TLR通路而發揮作用。而Lunding等[25]發現IL-37可通過直接抑制Th2型細胞而發揮作用。IL-37對抗過敏性哮喘的機制可能涉及多靶點、多通路，但何種靶點或通路發揮了主要作用目前尚不得而知。

表 2 過敏性哮喘小鼠造模方法及表型變化

注：HDM：屋塵螨；AHE：曲霉菌絲提取物；BALF：支氣管肺泡灌洗液；iNOS：誘導型一氧化氮合酶；SOD：超氧化物歧化酶。

Note: HDM, house dust mite. AHE, aspergillus hyphal extract. BALF, bronchoalveolar lavage fluid. iNOS, inducible nitric oxide synthase. SOD, superoxide dismutase.

3 變應性接觸性皮炎

變應性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)是由T淋巴細胞介導的遲發型(IV型)超敏反應，其致敏原為被稱為半抗原(分子量小于500×103)。半抗原并不具備抗原性，但可與載體蛋白形成半抗原-載體蛋白復合體，皮膚的樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)可將其捕獲并移行至淋巴結。

抗原的呈遞使T淋巴細胞致敏分化為不同亞群，如Th1細胞、Tc1細胞。當機體再次接觸到過敏原后，Th1/Tc1細胞被激活并產生IFN-γ，并激活臨近角質細胞而產生炎性反應[29]。

ACD動物模型又稱為接觸性超敏反應 (contact hypersensitivity，CHS)，其半抗原主要有二硝基氟苯(dinitrofluoroben-zene，DNFB)、惡唑酮、三氯乙烯、甲苯二異氰酸酯、熒光素-5-異硫氰酸鹽和硝基氯代苯(Trinitrochloro-benzene，TNCB)、等。目前經典的ACD小鼠動物模型建立方法為采用DNFB腹部涂抹，待小鼠全身致敏后，DNFB耳廓或背部涂抹激發(表3)。

目前已發現DCs三種亞群，即朗格漢斯細胞(Langerhans cells，LCs)、CD103-DCs、CD103+DCs。傳統觀念認為，皮膚中含有大量LCs、易于和抗原復合物結合且具有抗原呈遞功能，其應該為誘導Th1/Tc1的主要細胞。但研究者敲除LCs基因后，發現CHS無明顯改變；而敲除CD103+DCs基因后，CHS反應明顯下降[35-36]。而Edelson等[37]又發現Batf-/-小鼠(先天性缺乏CD103+DCs基因)的CHS又未受到影響。因此DCs調控CHS的具體機制還需進一步研究。

有研究發現，維生素D可通過抑制Toll樣受體抑制炎性反應，增強IL-10的產生，抑制DCs活化，降低Th1相關細胞因子的產生，誘導Treg細胞產生以及抑制B細胞活化和IgE的產生來發揮免疫抑制作用[38-39]。Malley等[40]觀察到，缺乏維生素D的雄性小鼠對ACD更為敏感，而在雌性小鼠中無此現象存在。這提示維生素D可能確實存在抑制ACD作用，但目前此方面報道尚少，確切機制尚不清楚。

表 3 接觸性皮炎小鼠造模方法及表型變化

注：TNCB: 2,4,6-三硝基氯苯；ASCs: 脂肪組織源性多能干細胞；SADBE: 接觸敏化劑; DNCB:二硝基氯苯; Ox: 惡唑酮; DNFB: 2，4-二硝基氟苯。

Note. TNCB, 2,4,6-trinitro-1-chlorobenzene. ASCs, adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stem cells. SADBE, contact sensitizer. DNCB, dinitrochlorobenzene. Ox, oxazolone. DNFB, 2, 4-Dinitrofluorobenzene.

4 食物性過敏

食物性過敏(food allergy，FA)的發病率僅次于呼吸系統過敏，且多為IgE介導的I型超敏反應。目前，被國際免疫學會認定的食物性過敏原超過100種，但90%的食物性過敏由牛奶、雞蛋、魚類、貝殼類、花生、大豆、小麥、堅果8類食物引起。在美國，兒童發病率高達8%，成年人高達2%～3%[41]。

同過敏性哮喘、過敏性結膜炎動物模型類似，FA小鼠模型也需全身致敏(多為腹腔注射)，再予以口服抗原激發(表4)。由于食物中蛋白質的分子結構在胃腸道中會發生改變，其致敏性被降低，采取腹腔注射可更好的保證致敏原分子結構的完整性。此外，FA小鼠模型常會出現體溫下降、腹瀉等表現[46]。

在FA動物模型中，Th1相關因子(IFN-γ)含量顯著下降，而Th2相關因子(IL-4、IL-5、IL-13)含量上升，出現Th1/Th2失衡，即“Th1/Th2漂移”現象。Liotta等[47]發現Notch通路被阻斷后，IL-4含量降低但IFN-γ顯著上升，且小鼠過敏癥狀明顯減輕。這與Sauma等[48]的研究結果一致。提示Notch通路可能通過下調Th2，而上調Th1改善FA小鼠過敏癥狀。此外，Jiang等[49]在FA小鼠模型中使用Notch通路抑制劑后，發現淋巴細胞和脾單個核細胞中NICD、Hes-1表達下降，T-bet(Th1轉錄相關因子)表達上升，而Gata-3(Th2轉錄相關因子)表達降低。猜測Notch可能在轉錄水平上調節FA。但具體機制仍不清楚。

在FA動物模型中，研究者可排除眾多混雜因素，因此可以精確地評估致敏原、找到治病因素并采取有效的干預措施。但FA是一種全身性疾病，它與遺傳因素、環境因素以及個體易感性等均有很大關聯，因此很難精確判斷個體的發病情況，嚴重程度以及持續時間。但盡管如此，研究者仍不斷在動物模型的基礎上盡可能找到可能出現的過敏原，明確其危害程度與暴露因素，并在此基礎上避免具有易感體質的個體接觸該類過敏原。

5 小結與展望

由于人類生活環境的復雜性和多樣性，過敏性小鼠動物模型可能無法完全模擬過敏性疾病的流行病學、致病因素、疾病發展及轉歸，但其能夠較好地揭示相關細胞因子表達、信號通路轉導等信息。我們應該更為客觀、科學地看待此種局限性，盡管實驗動物研究已取得豐碩的結果，但向臨床醫學轉化仍然任重道遠。值得肯定的是，構建過敏性小鼠模型尋找過敏性疾病的潛在治療靶點仍是當前研究的熱點。此外，隨著高通量測序的使用成本逐步下降，使得非編碼RNA研究的不斷深入，又為過敏性疾病的深入研究提供了有力的工具和理論基礎。目前已知，外泌體廣泛存在于細胞及體液中，其可攜帶多種蛋白質、mRNA、非編碼RNA以及脂質等物質，作為細胞-細胞間信息傳遞系統而參與到機體免疫應答、抗原呈遞、細胞遷移、分化等生物學現象中。盡管外泌體在腫瘤學、遺傳學中已廣泛研究，但其在過敏性疾病研究中還需要進一步深入，如能深入挖掘過敏性疾病中外泌體與非編碼RNA、外泌體與蛋白組學的互相調控關系，外泌體與不同分子之間的直接交互作用導致分子拓撲結構改變對于疾病的影響，則可能對過敏性疾病的治療提供新的思路和靶點。

表 4 食物性小鼠造模方法及表型變化

注：BLG: β-乳球蛋白。

Note. BLG, β-lactoglobulin.