硅酸鈣基類預混合根管封閉劑生物學性能研究進展*

陳耀忠 潘 潔

根管充填目的是嚴密封閉根管，防止根管系統內的致病微生物及其代謝產物進入根尖周組織，并促進其病變愈合。根管封閉劑的作用是充填根管壁與固體充填材料(牙膠)之間的間隙，封閉側副根管、峽部、多個根尖孔及不規則根管系統，包埋殘留于根管系統內致病微生物等[1]。因此，根管封閉劑的性能是影響根管治療成功的重要因素之一。

根管封閉劑按照其主要成分可分為氧化鋅丁香油類、氫氧化鈣類、玻璃離子類、硅烷類、樹脂類及生物陶瓷類根管封閉劑。其中，生物陶瓷類根管封閉劑包括硅酸鈣基類、MTA 基類及磷酸鈣基類等三大類近十種品牌[1]。iRoot SP(2007 年加拿大Innovative BioCeramix 公司)及EndoSequnce BC封閉劑(2008 年美國Brasseler 公司)是兩種化學成分相似的硅酸鈣基類預混合根管封閉劑(premixed calcium silicate-based sealers，PCSS)[1-3]，該材料無需調制，可直接注入牙根管內，隨取隨用，臨床使用非常方便；而且具有生物相容性良好、根尖組織耐受、在固化反應中生成羥基磷灰石，可與牙本質形成化學性粘接等優良的生物學性能而受到廣泛關注。本文將對其生物相容性、生物活性及抑菌性等生物學性能的研究進展進行綜述。

1.生物相容性

在根管充填中，新鮮制備未固化的根管封閉劑可能會超出根尖狹窄處或側副根管外，與根尖周組織直接接觸；另外長期存留在根管系統內固化的根管封閉劑也可釋放化學成分到達根尖周組織，對根尖周組織產生影響。因此，根管封閉劑應具有良好的生物相容性，并被根尖周組織所耐受。學者們主要從整體水平、細胞水平及分子水平三個層次對其生物相容性進行研究。

1.1 整體水平 動物實驗能全面地反映生物材料作用于機體后的總體情況，與臨床實際情況相接近，是在整體水平上對根管封閉劑的生物相容性進行評價。Zhang 等[4]采用大鼠皮下植入及骨埋植實驗研究顯示iRoot SP 與ProRoot MTA 的組織相容性優于AH Plus(樹脂類根管封閉劑，P＜0.05)。Zaki 等[5]建立犬的上頜前磨牙根管治療模型，組織學研究顯示iRoot SP 及Apexit(氫氧化鈣類根管封閉劑)等材料在根尖周炎性浸潤和礦化評分平均百分比差別無統計學意義(P＞0.05)，均能促進根尖周組織的愈合。上述動物體內植入實驗研究結果表明PCSS 具有良好的組織相容性。

1.2 細胞水平 細胞毒性實驗是評價牙髓材料細胞相容性最常用的方法之一。學者們主要采用MTT 比色法、流式細胞儀及細胞熒光染色等方法對PCSS 的細胞相容性進行研究，絕大多數研究結果顯示與其它類型的封閉劑相比，其具有良好的細胞相容性[6-21]。例如Zoufan 等[8]采用MTT 比色法研究顯示：新鮮制備及固化的EndoSequence BC浸提液對小鼠成纖維細胞(L929)的細胞毒性與GuttaFlow(硅烷類根管封閉劑)相似(P＞0.05)，顯著小于AH Plus Jet(AH Plus 注射裝)及Tubli-Seal Xpress(氧化鋅丁香油類根管封閉劑)(P＜0.05)。Zhou 等[12]采用掃描電鏡(SEM)觀察人牙齦細胞在固化的EndoSequence BC 及AH Plus 樣品表面附著生長，但在MTA Fillapex(MTA 基類類根管封閉劑)樣品表面幾乎沒有細胞附著。與上述研究結果相一致，PCSS 對MG63 成骨肉瘤細胞[6]、人牙周膜細胞[9]、小鼠三叉神經節神經元細胞[18]及人骨髓間充質干細胞[20]等具有良好的細胞相容性。但也有不一致的研究結果，如Loushine 等[7]采用MTT 比色法研究顯示EndoSequnce BC 對小鼠成骨細胞(MC3T3-E1 cells)的毒性大于AH Plus(P＜0.05)，但隨著固化時間的延長，其細胞毒性逐漸減小。PCSS 細胞相容性研究結果的不一致可能與實驗情況差異有關，包括使用的細胞系、研究材料呈遞給細胞的方式等相關。

近年來，學者們模擬根管封閉劑在臨床體內環境，建立了三維的細胞培養體系，對PCSS 細胞相容性進行了研究。與傳統的二維細胞培養模型相比，三維模型中細胞行為更典型、穩定性更高、壽命更長，因而更具有生理學相關性[16]。Silva 等[16]通過建立二維及三維Balb/c 3T3 細胞培養模型研究顯示在AH Plus、MTA Fillapex 等五種根管封閉劑中，EndoSequence BC 的細胞毒性最低，MTA Fillapex 的細胞毒性最大(P＜0.05)。da Silva 等[17]建立根管充填模型及三維Balb/c 3T3 細胞培養模型研究顯示：EndoSequnce BC、EndoSeal(硅酸鈣基類封閉劑)及AH Plus 組與陰性對照組相似(P＞0.05)，無明顯細胞毒性，而MTA Fillapex 細胞毒性大(P＜0.05)。

1.3 分子水平 遺傳毒性是根管封閉劑對細胞遺傳物質的作用，可能影響其完整性，是致癌性最重要的指標之一[22]。Candeiro 等[14]采用微核試驗對比研究顯示EndoSequnce BC 浸提液組的人牙齦成纖維細胞出現微核百分數細胞與陰性對照組相似(P＞0.05)，顯著少于AH Plus(P＜0.05)。Nair 等[21]也通過微核實驗研究顯示iRoot SP 及EndoSequence BC 對L929 細胞的遺傳毒性顯著小于Tubli-seal(氧化鋅丁香油類封閉劑)(P＜0.05)。Eldeniz 等[13]通過γ-H2AX 識別抗體免疫熒光法測定研究iRoot SP、AH plus 等9 種封閉劑對慢病毒基因轉染人類端粒酶逆轉錄酶的牙周膜細胞DNA 雙鏈斷裂影響，結果顯示iRoot SP 遺傳毒性小。上述研究說明PCSS 具有很小的遺傳毒性，致癌性小。

另外，da Silva 等[17]采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)研究顯示EndoSequnce BC 不會促進Balb/c 3T3 的炎癥細胞因子如IL-1β 和IL-6 釋放，提示其可能不會促進根尖組織的炎癥。Ruparel 等[23]通過放射免疫測定法檢測顯示EndoSequnce BC 降低了大鼠三叉神經感覺神經元釋放降鈣素基因相關多肽(CGRP)，說明其可能不會加重患者的術后疼痛反應。

目前對PCSS 生物相容性研究以細胞毒性研究為主，但分子水平特別是基因水平等相關方面的研究較為缺乏。

2.生物活性

生物活性是理想根管封閉劑應具有的性能之一。如果根管封閉劑具有生物活性，它將通過沉積在其表面的羥基磷灰石與牙本質形成穩定的粘合，提高其粘結強度[24,25]。生物活性是硅酸鈣基類材料重要特點之一，相關研究顯示PCSS 具有體外生成磷灰石類材料的性能，如Carvalho 等[24]研究顯示充填了EndoSequnce BC 的根管樣品經模擬體液浸泡30d，在其與牙本質交界部位、牙本質內表面均有碳酸鈣晶體沉積。Han 等[26]研究顯示充填有EndoSequnce BC 等三種生物陶瓷類材料的根管樣品經不含鈣、磷的磷酸緩沖鹽溶液浸泡后，材料表面有鈣/磷比為1.6∶2.0 的針狀或葉狀的礦化物生成。

檢測生物材料在模擬體液浸泡后生成磷灰石材料可預測其在體內骨的生物活性，但這種方法還缺乏足夠的科學證據，例如SiO2，TiO2，ZrO2，Nb2O5和Ta2O5等金屬氧化物浸入模擬體液后具有體外生物活性，但在體內未能證實這些材料與骨結合的能力[27]。因此學者們研究了PCSS 的成骨誘導性能，如Güven 等[10]研究顯示MTA 和iRoot SP 能顯著促進了人牙胚干細胞Ⅰ型膠原(COL1A)和牙本質涎磷蛋白(DSPP)的mRNA 上調表達(P＜0.05)，說明這兩種材料能誘導人牙胚干細胞分化為成牙本質細胞樣細胞，但MTA 能提供更多的誘導電位和硬組織沉積。Chang 等[11]研究顯示iRoot SP 能增加人牙周膜細胞堿性磷酸酶(ALP)活性和礦化結節的形成，并促進OCN、OPN 等成骨相關的mRNA 上調表達，顯示出良好的成骨潛能。Zhang 等[6]采用qRT-PCR 及酶聯免疫吸附技術研究顯示iRoot SP 能促進3d 和6d 組人成骨肉瘤MG63 細胞的Ⅰ型膠原、骨鈣素和骨涎蛋白等與礦化相關的mRNA上調表達；6d 組的Ⅰ型膠原及骨鈣素等蛋白表達增加，說明iRoot SP 有促進成骨分化及礦化作用。因此，PCSS 具有一定的生物活性。

3.抑菌性能

根管治療能有效減少感染根管內的致病微生物，但由于根管系統的復雜性，一般難以清除所有微生物，殘留的微生物通常以生物膜的形式存留在牙本質小管、根管峽部和側副管中。因此，應用具有抑菌性能的根管密封劑有利于減少剩余微生物的數量或甚至根除感染。目前，學者們主要采用瓊脂糖擴散、直接接觸法及牙本質感染定量模型等方法對PCSS 的抑菌性能進行了研究，研究結果顯示其具有一定的抑菌性能[9,14,28-36]。

瓊脂糖擴散及直接接觸法是檢測根管封閉劑的抑菌性能最為常用的兩種方法，如Singh 等[33]采用瓊脂糖擴散抑菌實驗研究顯示EndoSequnce BC 對糞腸球菌的抑菌環為14.4±1.497mm，說明其有較強的抑制糞腸球菌的性能。Zhang 等[28]采用改良的直接接觸法研究顯示iRoot SP、AH Plus 及EndoRez等根管封閉劑對糞腸球菌有抑制作用，但材料的抑菌性能隨著固化時間的延長逐漸減弱。Ozcan 等[29]采用直接接觸法研究顯示新鮮制備的iRoot SP 與MTA Fillapex 對白色念珠菌有抑制作用，但固化1d 及7d 組的材料無抑制作用。瓊脂糖擴散法操作簡單、靈活，但其實驗結果會受到材料溶解性及擴散性能的影響，不一定能反映根管封閉劑的真正抑菌潛能；而直接接觸法不受研究材料溶解性及擴散性影響，實驗結果更加準確，因而更適合于檢測根管封閉劑等不溶材料的抑菌性能[35]。上述這兩種方法的研究結果表明PCSS 具有一定的抑菌作用，且其抑菌性能與其固化狀況相關。

瓊脂擴散實驗及直接接觸實驗只能檢測根管封閉劑對游離培養的微生物的抑菌作用，而Ma 等[36]通過將糞腸球菌混懸液離心的方法建立了一種標準化的牙本質感染定量模型，可用于檢測根管封閉劑對生物膜和感染牙本質中微生物的抑制作用。Wang等[30]采用新型牙本質感染模型研究顯示：與AH Plus 一致，EndoSequnce BC 對牙本質小管中的糞腸球菌具有顯著的抗菌作用，且封閉劑與感染牙本質接觸時間越長，抑菌效果越佳，差別有統計學意義(P＜0.05)。Du 等[31]采用牙本質感染模型進一步研究顯示AH plus、EndoSequnce BC 組等與次氯酸鈉(NaClO)聯合使用對糞腸球菌的抑菌效果要優于單純封閉劑組及單純次氯酸鈉組(P＜0.05)，具有協同作用。PCSS 牙本質感染定量模型的研究結果與直接接觸法并不完全一致，其持久的抑菌性能可能與硅酸鈣/磷酸鹽引起的生物礦化以及牙本質礦物參與相關[30,31]。

與上述PCSS 抑菌性能研究結果并不完全一致，Shin 等[34]研究顯示EndoSequnce BC 封閉劑的PBS 浸提液對牙髓卟啉菌及牙齦卟啉菌的抑制作用弱；Willershausen 等[9]研究顯示EndoSequence BC 不能抑制糞腸球菌、微小微單胞菌在其表面粘附生長，說明其無抑菌作用。

PCSS 抑菌性研究結果顯示其具有一定的抑菌性能，但不同的研究方法結果存在爭議。目前的研究對象多為游離菌或單一細菌的生物膜，但在臨床根管感染中存在的是含有不同細菌的混合生物膜，因此PCSS 對混合菌生物膜的抑菌性能還需進一步研究。

4.生物學性能的機理

PCSS 良好的生物學性能可能與其材料成分及其固化后的產物相關。PCSS 的主要成分為硅酸三鈣、硅酸二鈣、磷酸氫鈣、氫氧化鈣、氧化鋯、填料以及不含水的增稠劑預混合而成[2,3,37]。當PCSS充填于根管內，硅酸三鈣、硅酸二鈣可吸收根管內或牙本質小管內殘留的水分而引發水化反應生產硅酸鈣水合物凝膠和氫氧化鈣(見化學反應式1,2)；氫氧化鈣與磷酸根離子反應沉淀羥基磷灰石和水(見化學反應式3)；生成的水使得水化反應循環繼續[25,37]。

新鮮制備的PCSS 在水化反應中生成強堿性的氫氧化鈣，其pH 值很高，可導致相鄰細胞和中等蛋白質變性，產生輕微細胞毒性作用；但氫氧化鈣又能通過損傷細菌膜或DNA、使蛋白質變性等對糞腸球菌等革蘭氏陰性菌具有殺菌作用[2,28,38]。因此，在很多的相關研究顯示新鮮制備的PCSS 會出現較強的抑菌性能及一定的細胞毒性。但隨著材料的固化反應的進行，氫氧化鈣與磷酸根離子反應生成羥基磷灰石，其pH 逐漸降低，細胞損傷逐漸消退，抑菌性能也減弱。羥基磷灰石是人體硬組織主要組成成分，不僅具有良好的生物相容性，而且可能有助于增加細胞礦化基因表達并起到鈣化激活劑的作用，促進細胞的成骨分化，因而PCSS 具有一定的生物活性[1,6,39,40]。另外，PCSS 水的接觸角小，呈親水性，因此該類材料易于滲入牙本質小管內，使得該材料能與牙本質小管內的微生物生物膜直接接觸，提高其抑菌性能，并通過羥基磷灰石的沉積與牙本質形成穩定的粘合，提高與牙本質的粘合強度及封閉性能[25]。

5.總結與展望

綜上所述，PCSS 具有良好的生物相容性、生物活性及抑菌性能，臨床應用前景良好，但其生物學性能的研究如分子生物相容性、混合菌生物膜的抑菌性能等還有待于進一步深入研究。