抗苗勒管激素的單克隆抗體制備與鑒定

蘇曉菱 李麗鎣 李苗苗 何潔 王瑞雪 王勇.2★ 羅樹紅★

抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）作為女性卵巢儲備功能的評價以及輔助生殖技術中卵巢反應性評估的激素，是由睪丸支持細胞和卵巢顆粒細胞分泌。與其他臨床常用卵巢功能的生物學指標相比AMH 濃度相對穩定［1］。隨著國內“二孩”政策的開放，評估高齡女性卵巢儲備功能成為了輔助生殖技術中至關重要的一環［2］。研究表明抗苗勒管激素是評價卵巢儲備功能的穩定指標，不受月經周期、口服避孕藥、促性腺激素釋放激素的影響，是評價卵巢儲備功能最直接、準確的指標。血清AMH 的水平與年齡呈負相關。其水平低于相應年齡段正常參考范圍，則可認為卵巢早衰。高水平的AMH 為多囊卵巢綜合癥的診斷提供依據［3-5］。將純化后的原核表達的AMH 蛋白作為抗原免疫小鼠。將抗AMH 蛋白單克隆抗體應用到評估卵巢儲備能力的診斷中。現今已發展到全自動AMH 檢測技術［6-7］，簡化了繁瑣的操作步驟。本抗體對有望替代進口AMH 抗體，降低AMH 診斷試盒的成本。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

AMH 重組蛋白由本實驗室制備；BALB/c 小鼠購自南方醫科大學實驗動物中心；SP2/0 小鼠骨髓瘤細胞由本實驗室保存并培養。

1.2 試劑

HAT/ HT 選擇性培養基及添加劑、福氏佐劑、細胞融合劑PEG1450 均購自美國Sigma 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 購自上海生工生物工程；胎牛血清、DMEM 培養基均購自中國GIBCO 公司；Protein G 親和層析柱和NI-NTA 親和層析柱購自GE 醫療中國；BCA（Bicinchoninic acid, BCA )蛋白定量檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術公司（Beyotime Biotechnology）。

1.3 AMH 蛋白的制備與純化

選取合適的AMH 基因，優化使其適合于大腸桿菌中表達。構建質粒表達載體，利用化學誘導法使大腸桿菌成為感受態細胞，進行轉化。將穿刺菌至于含卡那霉素（Kan）的培養基中37℃培養12～16 h，取菌液于含Kan 的LB（Luria-Bertani）細菌培養基上劃線，37℃過夜培養。挑選出平板中淡黃色菌落，內含重組質粒的大腸桿菌，至于含抗性LB 液體培養基中培養4～6 h。完成后菌液分成兩份，分別用于制備菌種和PCR 擴增和電泳分析。經PRC 鑒定和測序正確的菌液加入甘油，然后添加甘油并保存在-80℃。

取甘油菌至LB 液體培養基中培養過夜，37℃，220 rmp 振搖，至OD=0.6，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-b-D-thiogalactoside，IPTG)，至終濃度梯度為0.5 mM。取500 μL 菌液作為負對照，IPTG 37℃下誘導表達4 h。收取菌體，經破碎、離心處理后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測AMH 重組蛋白的表達。優化表達條件后，進行AMH 蛋白大量表達，并對可溶性蛋白通過NI-NTA 親和層析柱（GE）純化，純化的物質通過SDS-PAGE 電泳，并用考馬斯藍染色以評估其分子量，BCA 蛋白檢測試劑盒測定AMH 蛋白的濃度。

1.4 動物免疫

以純化后的AMH 重組蛋白為免疫原，首次AMH 重組蛋白與等體積的福氏佐劑充分乳化，分別50 μg，以100 μg/只的量于BALB/c 小鼠背部皮下多點注射免疫。二次、三次免疫同樣使用50 μg AMH 重組蛋白與等量不完全福氏佐劑。每次免疫的時間間隔為兩周，在三次免疫的一周后，采血、分離血清進行間接ELISA 以檢測小鼠體內抗AMH 蛋白抗體的效價。選免疫效價高的免疫小鼠取脾，準備骨髓瘤-脾細胞融合實驗。

1.5 細胞融合和雜交瘤細胞的篩選

細胞融合和雜交瘤細胞的篩選具體實驗步驟請見參考文獻［8］。經過3 次亞克隆后，即得到能穩定分泌特異性抗AMH 蛋白抗體的雜交瘤細胞株，并擴大培養于液氮保存。

1.6 單克隆抗體的制備［9］

單克隆抗體的制備實驗具體步驟請見參考文獻［9］。采用8～10 周齡的BALB/c 小鼠腹腔注射雜交瘤細胞，抽取腹水后離心，Protein G 親和純化得到單克隆抗體。

1.7 單克隆抗體效價測定

使用ELISA 間接法［10］：①包被：將重組抗原以1 μg/mL，100 μL/孔包被酶標板，置于4℃孵育過夜；封閉：用PBST 洗凈ELISA 板，加入200 μL/孔5%的脫脂奶粉，于37℃封閉2 h，以占據固相中未被重組抗原包被的位點，減少非特異性反應；③反應：洗板后，加入倍比稀釋濃度的抗體（分別為500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8、0.0 ng/mL），100 uL/孔，置于37℃孵育1 h；④加入二抗：洗板后，加入適當稀釋度的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，置于37℃孵育1 h；⑤顯色：加入TMB 顯色底物100 μL/孔，反應10 min；⑥終止：加入50 μL 2 mol/L 硫酸終止液終止反應；⑦讀數：酶標儀于450 nm 處，讀取各孔OD 值。

1.8 單克隆抗體的亞型鑒定

應用小鼠單克隆抗體亞型檢測試劑條對抗體的亞型進行檢測，根據使用說明書操作，將70 μL細胞培養上清加到試劑條的加樣區，10 min 后，與參照卡比對，確定抗體亞型。

2 結果

2.1 AMH 重組蛋白的小量表達與純化

經過37℃誘導表達4 h 和25℃誘導表達過液，菌體收集破碎，SDS-PAGE 分析（圖1）發現，AMH蛋白主要在包涵體中表達。37℃條件下，表達量更高且更省時，所以以37℃誘導表達4h，進行大量表達。經SDS-PAGE 膠分析，NI-NTA 親和層析柱純化后的AMH 蛋白純度達85%以上，蛋白分子量大約40 k 左右。見圖2。

圖1 AMH 蛋白小量表達Figure 1 Small amount of AMH protein expression

圖2 SDS-PAGE 分析AMH 純化蛋白Figure 2 The purified AMH protein demonstrated with SDS-PAGE

2.2 小鼠免疫效價測定

純化的AMH 重組蛋白混合福氏佐劑用作免疫原，通過多次皮下注射使小鼠產生相應的抗體。免疫3 次后，小鼠取血進行抗體效價評估。在1∶128 000 處的OD 值超過陰性對照的OD 值的2.1 倍，而1∶256 000 時，OD 值小于陰性對照OD 值的2.1 倍，為陰性結果。見圖3。

圖3 小鼠血清免疫效價Figure 3 Analysis of the immunopotency of mouse serum

2.3 雜交瘤細胞株的篩選

于96 孔ELISA 板中選取陽性孔，經有限稀釋法對其進行克隆化，3 次亞克隆后，即得到能穩定分泌特異性抗AMH 蛋白抗體的雜交瘤細胞株，得到2 株雜交瘤細胞，孔內上清抗體檢測為陽性。將2 株能穩定分泌特異性抗AMH 蛋白抗體的雜交瘤細胞，分別命名為3F6、4E7。

2.4 單克隆抗體的純化

經Protein G 親和層析法純化后的單克隆抗體進行SDS-PAGE 電泳，圖4 中可見55 kD、25 kD 兩條清晰的條帶，其中位于55 kD 的為抗AMH 重組蛋白抗體的重鏈，25 kD 為其輕鏈。

2.5 單克隆抗體效價測定、亞型鑒定

無菌抽取小鼠腹水，使用間接ELISA 法于450 nm 處定量檢測腹水中抗體效價為6.25 ng/mL，見圖5。使用亞型檢測試紙條，可直觀得出2 株單克隆抗體均為IgG1 型，見圖6。

圖4 單克隆抗體分析Figure 4 The analysis of monoclonal antibody with SDS-PAGE

圖5 單克隆抗體的效價Figure 5 Concentration of 3F6 and 4E7 antibody

圖6 抗體亞型鑒定Figure 6 The subtype identification of antibody

3 討論

利用大腸桿菌作為原核表達的表達系統，可構建出AMH 基因的原核表達載體并誘導表達出AMH 蛋白。大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，在此溫度下易生成包涵體蛋白。同時，包涵體的形成是目的蛋白表達量很高的表現。本項目采取降低IPTG 濃度并延長誘導時間的方法獲得更多可溶蛋白。動物免疫制備單克隆抗體的過程中，若AMH 蛋白不純會影響抗體的產生。采取多次多點注射以提高小鼠血清的免疫效價。經過3 次免疫的小鼠產生的抗體效價達1∶128 000。可認為此時小鼠體內產生抗AMH 重組蛋白的抗體的能力較為活躍，制備脾細胞懸液。于小鼠腹腔注射雜交瘤細胞前，注入降植烷可加速瘤細胞的生長。

本研究經對重組AMH 蛋白雜交瘤細胞采用有限稀釋法連續進行3 次亞克隆，成功制備出2 株抗苗勒管激素單克隆抗體，并進行效價的測定和亞型的鑒定。方法步驟較繁瑣，而且鼠源性的單克隆抗體有一定的應用局限性［9］。可有新穎、可行的方法供純化單克隆抗體的應用［11］。血清中AMH 作為卵巢儲備功能的血清標志物，具有預測卵巢儲備、妊娠結局的功能［12-14］，高水平AMH 對卵巢顆粒細胞瘤的診斷有重要的意義［15］。同時，AMH 水平的高低比年齡更能準確地預測婦女的更年期［16］。制備出的抗苗勒管激素單克隆抗體可用于血清AMH 的定量檢測，采用的檢測原理為雙抗體夾心法，將其應用于全自動免疫分析儀的試劑中。AMH 測量的可靠性和可重復性引起了許多疑問，自2014年以來，已經開發出自動加樣提高AMH 測量的靈敏度和可重復性。自動化方法的準確度提高了四倍，速度更快需要的血清量更少［1］。但要注意用于檢測的AMH 免疫測定法并未使用相同的抗體對，因此仍然有必要定義特定的參考值和臨界點［6］，對檢測結果解釋不能一概而論。依據現今科技發生的速度，預測在不久將來，可將其應用于免疫層析試紙條的檢測AMH。在這醫學技術日益發展的今天，深入探究更多檢測試劑核心原料的作用與來源，可通過現今技術，進行改良與優化，有利于推動檢驗技術的發展，惠及更多人群。