子宮內膜異位癥患者血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平及與不孕的關系

顧曉荔 吳新華 姬夢鴿 符元元★

子宮內膜異位（endometriosis，EMs）是子宮內膜組織在經期脫落后轉移到宮腔以外的其他部位而引發的疾病，育齡婦女的發病比例約占10%左右［1］。經血中的內膜碎片隨血液循環轉移至盆腔，可導致盆腔黏連、痛經和不孕癥的發生［2］。EMs 的發病機制復雜，醫學界尚未形成統一的認識，目前廣泛得到認可的有是經血逆流-內膜種植學說。子宮內膜組織由宮腔轉移到盆腹腔需突破腹水、腹腔細胞和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）三道防線，才能完成異位部位的種植和生長［3-4］。因而有研究人員推測，部分細胞因子和活性酶在組織的轉移和侵襲過程中發揮了重要作用［5］。相關研究證實，基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）可降解ECM 的膠原蛋白和纖維連接蛋白等成分，破壞ECM 結構的完整性，而基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是其天然抑制物，兩者含量的變化對EMs 疾病的發生和進展有密切聯系［6］。單核細胞 趨 化蛋 白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）是趨化因子家族中的一員，在EMs 的炎癥損傷和盆腔黏連中發揮重要作用［7］。本研究旨在觀察EMs 患者血清細胞因子及活性酶水平，為EMs 及相關不孕癥的發生及診斷治療提供數據支持，現匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月至2018年12月于鄭州大學第二附屬醫院婦產科就診的EMs 患者102例，根據美國生育協會（revised American Fertility Society，rAFS）分期標準［8］，其中Ⅰ期27 例，Ⅱ期29例，Ⅲ期25 例，Ⅳ期21 例。將102例EMs 患者中的54 例不孕患者作為觀察組，48 例非不孕患者作為對照組。觀察組年齡26～41 歲，平均年齡（30.42±4.20）歲，病程（0.5～8）年，平均（3.86±1.64）年；對照組年齡25～42 歲，平均（30.76±4.55）歲，病程1～7年，平均（3.72±1.60）年。兩組患者年齡、病程等一般資料比較無統計學差異（P＞0.05）。納入標準：①符合EMs 診斷標準［9］；②所有患者知情且自愿參與實驗研究。排除標準：①半年內曾使用激素治療；②惡性腫瘤患者；③子宮腺肌癥患者。

1.2 試劑/儀器

血清基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）試劑盒購自美國ThermoFisher 公司。離心機為德國艾本德公司生產。檢測儀器為芬蘭Labsystem 公司生產的MK3 型全自動酶標儀。

1.3 實驗室檢測

1.3.1 樣本采集

采集所有研究對象外周血4 mL，3 000 r/min低溫離心10 min ，取上層血清置于-80℃冰箱備用。

1.3.2 酶聯免疫吸附法檢測

將所有患者的備用血清及酶聯免疫吸附試劑盒置于常溫下復蘇。按照說明書要求進行加樣，封口后置于37℃恒溫箱內孵育，反復沖洗3 次，倒置將孔內殘余液體吸干。加入相應抗體，封口后繼續孵育，重復上述清洗步驟。加入酶標抗體100 μL，避光孵育30 min，重復清洗步驟。加入底物工作液，孵育15 min，終止反應，使用酶標儀讀數。

1.4 治療方法

兩組患者均經腹腔鏡病灶切除和粘連分離術治療，統計兩組患者術后血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平。

1.5 統計學處理

采用SPSS 23.0 件進行數據分析，計數資料用%表示，采用χ2檢驗，計量資料用（）表示，采用t檢驗，等級比較使用秩和檢驗；血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平的相關性分析采用Pearson分析，不孕癥的多因素分析采用Logistic 回歸分析。以P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者rAFS 分期、血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平比較

觀察組rAFS Ⅲ期與Ⅳ期患者比例明顯高于對照組，血清TIMP-1 水平顯著低于對照組；觀察組MCP-1、MMP-9水平顯著高于對照組，差異有統計學意義。（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者rAFS 分期、血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平比較［n（%），（±s）］Table 1 RAFS stages，levels of serum TIMP-1，MCP-1 and MMP-9 in different groups［n（%），（±s）］

表1 兩組患者rAFS 分期、血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平比較［n（%），（±s）］Table 1 RAFS stages，levels of serum TIMP-1，MCP-1 and MMP-9 in different groups［n（%），（±s）］

注：與對照組相比，aP＜0.05。

組別觀察組對照組n 54 48Ⅰ期0（0.00）a 18（37.50）Ⅱ期1（1.85）a 15（31.25）Ⅲ期18（33.33）a 10（20.83）Ⅳ期35（64.81）a 5（10.42）TIMP-1（ng/mL）205.19±41.31a 308.56±52.19 MCP-1（pg/mL）45.67±5.36a 26.18±4.27 MMP-9（ng/mL）413.56±61.79a 278.19±54.37

2.2 不同分期患者血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平比較

EMs Ⅰ期患者血清TIMP-1 水平高于Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期（P＜0.05）；隨著rAFS 分期的增高，TIMP-1水平呈下降趨勢（P＜0.05）；EMs Ⅰ期患者血清MCP-1、MMP-9水平低于Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期（P＜0.05）；隨著rAFS 分期的增高，MCP-1、MMP-9水平呈上升趨勢（P＜0.05），見表2。

2.3 兩組治療前后血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9比較

兩組患者治療后TIMP-1 顯著增加（P＜0.05），MCP-1、MMP-9水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

2.4 EMs 血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平的相關性

EMs 患者血清TIMP-1 與MMP-9水平呈強相關（P＜0.05）；MCP-1 與TIMP-1 水平呈弱相關（P＜0.05）；MCP-1 與MMP-9水平呈弱相關（P＜0.05），見表4。

表2 觀察組不同分期患者血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平比較［n，（±s）］Table 2 Levels of serum TIMP-1，MCP-1 and MMP-9 in patients at different stages in the observation group［n，（±s）］

表2 觀察組不同分期患者血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平比較［n，（±s）］Table 2 Levels of serum TIMP-1，MCP-1 and MMP-9 in patients at different stages in the observation group［n，（±s）］

注：與Ⅰ期相比，aP＜0.05；與Ⅱ期相比，bP＜0.05；與Ⅲ期相比，cP＜0.05。

組別Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期n 27 29 25 21 TIMP-1（ng/mL）376.18±56.12 312.68±54.19a 261.24±46.78ab 213.78±40.57abc MCP-1（pg/mL）24.65±3.96 31.74±4.23a 39.82±4.54ab 43.21±5.20abc MMP-9（ng/mL）220.64±42.38 243.17±47.62a 321.35±50.62ab 375.12±58.47abc

表3 兩組治療前后血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9 比較［n，（±s）］Table 3 Serum TIMP-1，MCP-1 and MMP-9 in the two groups before and after treatment［n，（±s）］

表3 兩組治療前后血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9 比較［n，（±s）］Table 3 Serum TIMP-1，MCP-1 and MMP-9 in the two groups before and after treatment［n，（±s）］

注：與治療前相比，aP＜0.05。

組別觀察組對照組n 54 48 TIMP-1（ng/mL）治療前205.19±41.31 308.56±52.19治療后375.24.56±66.19a 364.21±65.12a MCP-1（pg/mL）治療前45.67±5.36 26.18±4.27a治療后19.37±4.57a 18.21±4.52a MMP-9（ng/mL）治療前413.56±61.79 278.19±54.37治療后222.51±57.22a 219.24±55.71a

2.5 血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平與不孕癥的logistics 回歸分析

以是否不孕為因變量，以EMs患者血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平為自變量進行logistics 回歸分析，結果顯示，血清TIMP-1、MMP-9 與不孕癥的發生具有相關性（P＜0.05），見表5。

3 討論

EMs 雖屬于良性病變，但也存在著向惡性轉變的可能。脫落的子宮內膜上皮細胞若想發生侵襲轉移，EMC 是必須突破的第一道屏障［10］。相關文獻證實，具有侵蝕EMC 能力的宮腔內組織才能完成異部位的定植和生長［11］。MMPs 是一類在金屬離子輔助作用下發揮生物學活性的蛋白酶。有研究顯示，MMPs 可降解EMC 中的膠原、纖維連接蛋白等成分，破壞機體的組織學屏障，在細胞的浸潤轉移中發揮重要作用［12］。MMP-9 經有機汞激活后，可降解EMC 和重塑其動態平衡［13］。Rai 等人［14］在研究中發現，MMP-9 對EMs 的發生不限于促進EMC 的降解，還具有誘導血管生成的作用。TIMP-1 作為MMP-9 的抑制劑，可特異性的與羧基末端結合后抑制其活性。此外，TIMP-1 還對細胞的增殖和凋亡具有調控作用［15］。陳志華等［16］的研究結果顯示，EMs 患者血清MMP-9水平與病情的進展程度密切相關。馬艷鴿等［17］在通過靶向沉默COX-2 基因后發現，原代培養的子宮內異癥細胞MMP-9 表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著增加，因而猜測MMP-9 的表達水平可能與內異癥細胞的凋亡有關。本研究結果顯示隨著rAFS 分期的增高，EMs 患者TIMP-1 呈下降的趨勢，MMP-9 呈上升的趨勢，提示TIMP-1/MMP-9 可能與EMs 的發生和進展存在一定的關聯。任威等［18］采用腹腔鏡手術聯合米非司酮治療EMs 患者，觀察組患者臨床癥狀明顯減輕，血清TIMP-1、MMP-9水平較治療前也顯著下降，與本研究結果相符，證實了MMP-9水平與疾病的關聯。EMs 患者中合并不孕癥的比例高達40%，EMs 可造成孕齡婦女輸卵管阻塞、盆腔炎癥、黃體功能異常等疾病，給女性的生殖系統造成嚴重侵害［19］。EMs 患者免疫功能異常，可導致腹盆腔的炎癥反應，各種炎性介質和趨化因子呈高表達，造成患者盆腔及腹腔環境的改變，營造有利于宮腔組織種植的環境，損害生殖系統的正常功能，進而導致不孕。本研究中EMs 組血清MCP-1 水平顯著高于健康組，且隨著疾病的進展，MCP-1 水平逐漸升高，提示MCP-1 在EMs的疾病演化中扮演重要角色。本研究還發現，EMs組中不孕癥患者MCP-1 水平顯著高于非不孕組，但血清MCP-1 水平與不孕癥的發生并無相關。

綜上所述，EMs 不孕患者血清TIMP-1 水平顯著低于Ems 非不孕患者，MCP-1、MMP-9 高于Ems非不孕患者，且隨著rAFS 分期的增高，TIMP-1 表現出下降趨勢，MCP-1、MMP-9 表現出升高趨勢。血清TIMP-1、MMP-9 與不孕癥的發生具有相關性。

表4 觀察組患者血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平的相關性Table 4 The correlations among serum TIMP-1，MCP-1 and MMP-9 levels in the observation group

表5 血清TIMP-1、MCP-1、MMP-9水平與不孕癥的logistics 回歸分析Table 5 Logistics regression analysis of the correlation between serum TIMP-1，MCP-1，MMP-9 levels and infertility