缺血性腦卒中患者單個核細胞TLR3、IRF-3、IFN-γ mRNA表達及臨床意義

李邦林 賈漢偉 李靖 李剛

缺血性腦卒中是神經內科最為常見疾病，發病率高、致殘率高、病死率高，并且隨著我國步入老齡化社會后本病發病率呈現升高的趨勢。目前有效治療方法是發病后（3～4.5）h 開展靜脈溶栓，但受有限時間窗及醫療條件的限制，很少有卒中患者能得到這種措施的治療。因此深入研究缺血性腦卒中的發病機制，有重要的臨床的意義［1］。近年來研究發現，缺血后的炎癥反應，如Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）、干擾素調節因子（Interferon regulatory factors，IRFs）等在腦缺血繼發性腦損害中可能具有重要作用［2］。TLR 屬于天然免疫受體家族，可以識別并結合病原體的特定分子結構［3］。IRFs 屬于重要的轉錄調節因子，在TLR 介導的髓樣分化因子非依賴信號轉導通路中發揮抵抗病原體入侵的作用［4］。干擾素調節因子3（interferon regulatory factor -3，IRF-3）活化后形成同源二聚體轉位入核，誘導β 干擾素基因表達［3］。上述3 個因子在腦缺血發作中均會出現變化，但是對缺血性腦卒中患者的病情嚴重程度則臨床報道較為少見，本文重點研究了缺血性腦卒中患者單個核細胞Toll 樣受體3（Toll like receptor 3，TLR3）以及IRF-3、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月至2019年7月在本院治療的缺血性腦卒中患者108 例（觀察組），發病至入院時間6～70 h，平均（34.40±9.80）h；根據中國急性缺血性卒中診治指南中的標準［5］，其中輕度、中度和重度患者分別30 例、42例和36 例；根據治療90 d 后mRS評分［6］評估，預后良好66 例，不良42例；納入標準：①診斷符合中國急性缺血性卒中診治指南中的標準；②發病至入院時間＜72 h；③患者及家屬知情同意。排除標準：①合并有顱內出血、急性心肌梗死、惡性腫瘤、肝腎功能不全、自身免疫性疾病等；②檢查前已行溶栓治療；③發病前已有肢體殘疾。同時選取健康志愿者80 例作為對照組，兩組受試者一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較［n，（±s）］Table 1 Comparison of 2 groups of general information［n，（±s）］

表1 兩組一般資料比較［n，（±s）］Table 1 Comparison of 2 groups of general information［n，（±s）］

組別觀察組對照組t/χ2值P 值n 108 80男/女66/42 50/30 0.038＞0.05年齡（歲）51.12±8.22 50.12±9.11 0.787＞0.05

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑/儀器

全自動化生化分析儀為日本日立公司提供，型號7600；流式細胞儀美國Beckman Coulter 公司型號EpicsXL；低溫冰箱為德國Liebherr 公司提供，型號321；酶標儀為瑞士Hamilton 公司提供，型號FAME24/20。臺盼藍溶液為Sigma 公司提供；Gimsa 染色劑為Sigma 公司提供；PBS 為武漢博士德公司提供，Trizol 試劑盒為Invitrogen 公司提供，RT-PCR 試劑盒為Promega 公司提供，引物合成為南京金思瑞提供。

1.2.2 操作方法

患者空腹抽取靜脈血10 mL，加入肝素抗凝，離心后分離血清待檢，采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。取已分離的外周血單個核細胞，加入RNAisoPlus 裂解后，先后加入氯仿、異丙醇、體積分數75%的乙醇低溫離心后獲得總RNA。反轉錄-聚合酶鏈反應：在50 μL的反轉錄反應體系中，以2.5 μg mRNA 為模板逆轉cDNA，取1 μL 的cDNA 為模板，進行PCR 擴增。反轉錄-聚合酶鏈反應產物鑒定：取TLR-3 和GAPDH 擴增產物3 μL 在2%瓊脂糖凝膠中，120 V電泳30 min，經紫外線圖像成像系統（DU640 型）觀察，并用凝膠成像儀進行拍攝；以驗證引物的特異性及獲得引物的最適退火溫度。采用SYBGreeen 試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司），使用ABl7000 型熒光定量PCR 儀檢測，應用Rotor gene 6 軟件進行熒光信號的收集和結果分析。熒光定量PCR 數據采用2-△△ct法進行相對定量。采用酶聯免疫吸附法測定IRF-3、IFN-γ濃度變化。

1.3 腦梗死體積測量

腦梗死體積測量均由同一醫師負責計算，患者在發病后1 周進行頭顱核磁共振檢查，在T2 加權像利用計算機后處理工作站對梗死組織邊緣進行劃分，使用感興趣區技術算出像素綜合，腦梗死體積為感興趣區內所有的像素總和與層厚和層間隔的積［5］。

1.4 美國國立衛生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale，NIHSS）和改良Rankin量表（Modified Rankin Scale，mRS）評分

一名醫師根據缺血性腦卒中病情嚴重程度采用NIHSS 評分評估，NIHSS＜4 分為輕度神經功能障礙，4～15 分為中度神經功能障礙，NIHSS＞15 分為重度神經功能障礙；治療90 d 后預后情況采用mRS 評分評估，mRS≤2 分為預后良好，＞2 分為預后不良［6］。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析，計量資料采用（）表示，計數資料用%表示，組間比較使用χ2表示，多組間比較采用方差分析，相關性采用Pearson 相關分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達比較

觀察組TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA expression between 2 groups［n，（±s）］

表2 兩組TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA expression between 2 groups［n，（±s）］

組別觀察組對照組t 值P 值n 108 80 TLR3 mRNA 7.211±2.121 2.012±0.851 20.713＜0.05 IRF-3 mRNA 5.801±1.821 1.043±0.342 23.055＜0.05 IFN-γ mRNA 6.270±1.533 1.673±0.452 25.982＜0.05

2.2 觀察組不同病情患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標比較

觀察組中不同病情患者TLR3、IRF-3、IFN-γmRNA 等指標中的比較結果：重度＞中度＞輕度，見表3。

表3 觀察組不同病情患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標比較［n，（±s）］Table 3 Comparisons of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA in patients with different conditions in observation group［n，（±s）］

表3 觀察組不同病情患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標比較［n，（±s）］Table 3 Comparisons of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA in patients with different conditions in observation group［n，（±s）］

注：a與輕度比較P＜0.05；b與中度比較P＜0.05。

病情程度輕度中度重度F/χ2值P 值例數30 42 36男/女20/10 28/14 18/18 2.805＞0.05年齡（歲）51.82±8.40 52.10±9.02 51.51±8.2 2.231＞0.05發病至入院時間（h）33.72±8.04 32.28±7.93 33.11±8.67 1.903＞0.05腦梗死體積（cm3）10.02±2.12 28.88±3.32a 39.56±3.43ab 45.312＜0.05 TLR3 mRNA 5.012±1.665 6.816±1.572a 8.021±1.601ab 21.021＜0.05 IRF-3 mRNA 3.102±1.022 5.003±1.212a 6.821±1.145ab 18.254＜0.05 IFN-γ mRNA 3.102±1.302 5.117±1.104a 7.014±1.062ab 20.212＜0.05

2.3 觀察組不同預后患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標比較

預后不良患者腦梗死體積、TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 相對表達量明顯高于預后良好患者（P＜0.05），見表4。

2.4 觀察組治療前后TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA比較

觀察組治療后TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 相對表達量較治療前降低（P＜0.05），見表5。

2.5 相關性分析

將患者TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA表達、NIHSS 評分、腦梗死體積進行相關性分析，結果顯示TLR3mRNA表達與IRF-3mRNA、IFN-γmRNA、NIHSS 評分和腦梗死體積呈正相關（r=0.561、0.508、0.400 和0.311，P＜0.05）；IRF-3mRNA 與IFN-γmRNA 呈正相關（r=0.302，P＜0.05）。

表4 觀察組不同預后患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標比較［n，（±s）］Table 4 Comparisons of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA in different prognosis patients in observation group［n，（±s）］

表4 觀察組不同預后患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標比較［n，（±s）］Table 4 Comparisons of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA in different prognosis patients in observation group［n，（±s）］

預后良好不良t/χ2值P 值n 66 42男/女40/26 26/20 0.187＞0.05年齡（歲）51.11±10.02 52.18±9.78-0.546＞0.05發病至入院時間（h）33.11±7.51 32.30±8.12 0.529＞0.05腦梗死體積（cm3）23.90±4.11 36.66±5.12-14.278＜0.05 TLR3 mRNA 6.881±1.732 7.712±1.422-2.600＜0.05 IRF-3 mRNA 5.101±1.131 6.422±1.103-5.974＜0.05 IFN-γ mRNA 5.901±1.225 6.761±1.322-3.449＜0.05

表5 觀察組治療前后TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達比較［n，（±s）］Table 5 Comparison of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA expression before and after treatment in observation group［n，（±s）］

表5 觀察組治療前后TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達比較［n，（±s）］Table 5 Comparison of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA expression before and after treatment in observation group［n，（±s）］

時期治療前治療后t 值P 值n 108 108 TLR3 mRNA 7.211±2.121 5.011±1.102 9.565＜0.05 IRF-3 mRNA 5.801±1.821 3.001±1.121 13.608＜0.05 IFN-γ mRNA 6.270±1.533 3.423±1.133 15.521＜0.05

3 討論

腦卒中發病后的神經功能損害與多種因素有關，其中繼發的炎癥反應導致的神經細胞的結構和功能的損害與腦卒中后的神經功能密切相關，因此控制患者發病后炎癥反應也是腦卒中患者治療的內容之一［7］。腦缺血損傷機制復雜，神經細胞凋亡、氧化應激反應、炎癥反應及免疫反應等均參與神經功能損害的過程［8-9］。

TRL4 是跨膜糖蛋白，是天然免疫及模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）家族最為重要的模式識別受體之一。TLRs 主要識別細胞外的病原微生物及組織損傷時釋放的內源性分子，即損傷相關的分子模式（DAMPs），啟動TLRs 信號通路進而誘導炎癥反應發生［10］。在腦缺血損傷過程中，TRL4 能夠通過信號轉導通路激活誘導下游的TLR3 及INF 的表達誘導炎癥反應發生及細胞凋亡的啟動［10］。單個核細胞是以白細胞為主的一類細胞，是機體免疫及炎癥反應的主要效應細胞，在腦缺血過程中，單個核細胞的激活與神經細胞的免疫損傷和炎性損傷密切相關［11］，目前在缺血性腦卒中患者，單個核細胞中TRL4 信號轉導通路的集火情況及其與腦缺血病情及預后的關系尚缺乏研究。

TLR3 被激活后可以募集調節蛋白、銜接蛋白誘導干擾素βTIR 同連接子進行結合，通過此途徑誘導INF 及NF-κB 的表達，并且能夠抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的多種信號通路，降低細胞因子TNF-α 的水平，從而減輕LPS 誘導的細胞和組織損傷［12］。能夠通過與受體結合因子3（TNF receptor associated factor 3，TRAF3）與腫瘤壞死因子受體相關因子聯合核因子-κB 激酶（TANK）結合激酶1（TBK1）相互作用，進而引發IRF3 磷酸化，磷酸化后IRF3 形成二聚體并發生核轉位，引起IFN-β 基因及其他可誘導基因的轉錄；干擾素是人體分泌糖蛋白，正常情況下具有抗病毒、調節人體免疫功能等多種生物學活性，研究發現IFN-γ受到TRIF途徑的調節，患者體內的促炎因子水平表達減少，能夠降低IFN-γ代表的表達水平。在缺血性腦卒中患者單個核細胞中TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 水平的變化，提示其可能通過激活相關的信號轉導通路，調節單個核細胞的生物學活性，直接及間接參與神經功能損害的過程［13-15］。

再進一步的研究中發現，在缺血性腦卒中患者單個核細胞中，TLR3mRNA 的表達水平同NISS評分及腦梗死的體積具有相關關系，而且同其下游的IRF-3和IFN-γmRNA 水平也呈現正相關關系，也提示在缺血性腦卒中患者TLR3 可能通過對IRF 和IFN-γ 的調節，參與神經功能損害的過程。

綜上所述，缺血性腦卒中患者TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA表達明顯升高，其中TLR3mRNA 與患者病情程度、腦梗死體積和預后有一定關系，提示檢測TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 有助于患者病情的判斷和預后的評估，并且可能能夠為缺血性腦卒中患者神經功能的保護和康復提供新的思路。