GAP-43蛋白表達與大鼠心力衰竭發病相關性分析

王娜 陳玉善 劉蕾 杜林翔 王書飛 左艷芳 李宗贏 李婷婷

心力衰竭（heart failure，HF）是指各種原因導致的心臟組織重構、心功能降低臨床表現為心室充盈、心室射血分數降低等的一種臨床綜合征，是常見的心血管系統疾病［1］。其發病率呈逐年上升趨勢。據流行病學資料估計，全國卒中患者不低于700 萬，心衰患者約450 萬左右，是常見的心血管患者死亡的主要原因［3-4］，慢性心衰患者住院30 d 死亡率達5.4%［5］。其發病機制，主要由于心輸出量減少，心腔壓力增加而激動神經體液調節機制，交感神經興奮，腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活，釋放大量去甲腎上腺素，心肌應激性增強而觸發惡性室性心律失常，嚴重導致心源性猝死［6］。神經生長相關蛋白-43（growth-associated protein 43，GAP43）是神經系統發育過程中高度表達的一種神經組織特異性磷酸蛋白質，參與軸突生長和突觸形成，是神經再生表達過程中的典型特征，可作為神經生長狀況的反映性標志物。GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平可反映神經重構水平，參與HF 發生發展機制［7］。為進一步確定GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平在HF 診斷中的價值，本研究應用心臟超聲評估大鼠左心室射血分數（Left ventricular ejection fraction，LVEF），應用qRT-PCR 方法檢測心臟組織GAP-43mRNA表達，Western blot檢測心臟組織GAP-43蛋白表達，試圖探討GAP-43蛋白的表達及其在心力衰竭發病機制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取清潔級Wistar 大鼠30 只，3月齡，體重180～200 g，雌雄各半，購自廣東省實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（粵）2013-0002，自由攝食和飲水，晝夜交替各12 h，隨機分為模型組和假手術組，每組各15 只，其中模型組造模過程中死亡4只。SPF 級Wistar 大鼠48 只，雌雄不限，體質量（200±20）g，購自遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK2010-0001。大鼠購入后，適應性飼養1 周，動物室保持室溫（20±2）℃，相對濕度45%，12 h 晝夜節律，自由飲水，常規顆粒飼料喂養，隔天更換一次墊料。

1.2 實驗方法

1.2.1 干預方法

手術組大鼠參見文獻建立DHF 模型［1］。手術嚴格無菌操作，每只大鼠術后給予30 萬U/（kg·d）青霉素肌肉注射3 d，預防感染，術后精心飼養。術后第8周開始，使用微升注射器，靜脈注射右下肢 急性心衰藥物RLX，RLX 小劑量組為30 μg/（kg·d），RLX 大劑量組為98 μg/（kg·d），給藥時間2 周。而非手術組應用生理鹽水以HF 組相同的方法、體積和時間進行注射。

1.2.2 心臟超聲檢查

2%戊巴比妥鈉以腹腔注射的方式（Sigma 公司，批號T0894）進行靜脈麻醉，固定每組大鼠的四肢，仰臥位。采用彩色超聲診斷儀（SONOS5500，Hewlett-Packard 公司）探頭選用動物專用小探頭（15 MHz，型號：Vevo 770）進行二維超聲的心臟形態和功能檢測，掃描范圍：大鼠胸骨旁。測量指標包括左心室射血分數（LVEF）、左心室舒張末容積（Left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV）。

1.2.3 qRT-PCR 檢查

總RNA 提取：按照Trizol 試劑盒（Invitrogen，美國，批號：15596-026）說明書進行，向大鼠心臟組織中加0.4 mL 的Trizol 試劑后勻漿，再加入1/5 Trizol 試劑體積量的氯仿，劇烈震蕩混勻，室溫下靜置5 min，4℃，12 000 g 離心15 min，取上清液至新離心管內，加入與上清液等體積量的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜置10 min，4℃，12 000 g 離心10 min，其上清液。向沉淀中加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，12 000 g，4℃離心5 min，其上清液保留沉淀并干燥。RNA OD 值A260/A280 在1.7～2.1為合格。PCR 擴增：按照反轉錄試劑盒（廣州瑞真生物有限公司，批號：RR047Q）說明書進行DNA 反轉錄；以反轉錄cDNA 產物為模板，按照實時熒光定量PCR 試劑盒（廣州瑞真生物有限公司，批號：RR430S）說明書進行熒光定量測定。PCR 反應體系如下：預變性30 s，95℃；擴增、延伸15 s，95℃；退火30 s，60℃，循環40 次，上游引物：ATTCAGGCTAGCTTCCGTGG，下游引物：GAAGGTGCATCTCCTGCCTT，產物片段為218 bp。

1.2.4 Western blot 檢查

取50 mg 分離得到的左心室組織的蛋白質，BCA 法（bicinchoninic acid）測量其蛋白濃度，將蛋白進行電泳、轉膜、GAP-43 一抗孵育（稀釋比例1∶400，武漢博士德生物試劑公司提供）、二抗孵育、雜交、顯影、曝光，所需的Western、IP 細胞裂解液、PMSF、增強型BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術研究所。條帶灰度值采用Image J 圖像分析軟件分析處理。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析，計量資料采用（）表示，組間比較使用t檢驗，相關性分析Pearson 相關分析。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠體質量比較

模型組和假手術組大鼠體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組大鼠體質量比較［n，（±s）］Table 1 Comparison of body weight between the two groups［n，（±s）］

表1 兩組大鼠體質量比較［n，（±s）］Table 1 Comparison of body weight between the two groups［n，（±s）］

組別模型組假手術組n 11 15體質量（g）194.49±10.20 191.18±9.22 t 值0.865 P 值0.396

2.2 兩組造模后4 周心臟組織GAP-43 mRNA 和蛋白表達

模型組心臟組織GAP-43mRNA 和蛋白相對表達量明顯低于假手術組，差異比較有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 兩組造模后4 周心臟組織GAP-43 mRNA 和蛋白表達［n，（±s）］Table 1 The expression of GAP-43 mRNA and protein in cardiac tissue 4 weeks after model establishment in two groups［n，（±s）］

表2 兩組造模后4 周心臟組織GAP-43 mRNA 和蛋白表達［n，（±s）］Table 1 The expression of GAP-43 mRNA and protein in cardiac tissue 4 weeks after model establishment in two groups［n，（±s）］

注：A.模型組；B.假手術組

組別模型組假手術組t 值P 值n 11 15 GAP-43 mRNA相對表達量0.300±0.073 0.902±0.089 18.335 0.000 GAP-43蛋白相對表達量0.373±0.043 1.210±0.133 20.023 0.000

2.3 兩組造模后4 周后LVEF 比較

模型組造模4 周后LVEF 明顯低于假手術組，差異比較有統計學意義（P＜0.05），見表3。

圖1 模型組和假手術組大鼠心臟組織gap-43蛋白的western blot 分析Figure 1 Western blot analysis of GAP-43 protein taken from heart tissue of rats in model group and sham-operated group

表3 兩組造模4 周后LVEF 比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of LVEF in two groups after 4 weeks of modeling［n，（±s）］

表3 兩組造模4 周后LVEF 比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of LVEF in two groups after 4 weeks of modeling［n，（±s）］

組別模型組假手術組n 11 15 LVEF（%）20.44±2.01 70.28±3.62 t 值41.110 P 值0.000

2.4 相關性分析

將模型組GAP-43mRNA 和蛋白相對表達量與LVEF 進行相關分析，結果顯示：GAP-43mRNA相對表達量與LVEF呈負相關（r=-0.707，P＜0.05），GAP-43蛋白相對表達量與LVEF 呈負相關（r=-0.600，P＜0.05）。見圖2。

圖2 心力衰竭大鼠GAP-43 mRNA 和蛋白相對表達量與LVEF 相關圖Figure 2 Analysis of correlation between relative expression of GAP-43 mRNA and protein and LVEF

3 討論

多數學者認為，HF 致交感神經興奮，神經組織重構可引起以室性心律失常為代表的各種心律失常臨床表現癥，嚴重可引起患者心源性猝死。故神經重構在HF 疾病進展過程中起著重要作用。目前關于神經重構致交感神經過度興奮相關性猝死的發病機制并未完全闡明，交感神經重構、心肌重構等相互作用一直被認為是心衰的主要發病機制［8］。有研究報道［9］HF 患者早期表現為交感神經興奮，去甲腎上腺素分泌增多，出現功能性交感神經去支配等現象，表現為反射性分泌去甲腎上腺素和酪氨酸羥化酶的水平下降，神經對去甲腎上腺素的重吸收能力降低，相應地，所需的去甲腎上腺素吸收載體-1 密度降低，最終使患者交感神經功能下降甚至喪失，長時間的心臟抑制作用，可加重心衰，嚴重導致死亡［10］。臨床上有研究報道［11］血管緊張素轉化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）類藥物可緩解患者的交感神經去支配現象，β 受體阻斷劑對臨床各種心律失常、提高室顫閾值、膜穩定、減少猝死等方面具有重要作用。目前已得到臨床的廣泛應用，具體作用機制尚不明確，可能與減慢心率、降低異位起搏點興奮性、延長房室結不應期、減慢傳導等具有密切關系。但仍需進一步研究。

GAP-43 是神經元上特異性的軸突膜蛋白質，又稱neuromodulin，參與神經細胞生長、突觸生成發育和神經細胞再生，在神經元的發育和再生過程中起著重要作用，同時，GAP-43 作為細胞內信號分子，調節軸突延伸作用，間接影響信號傳導途徑，也可通過增強與G 蛋白偶聯受體的轉運作用，直接促進細胞內的信號傳導。近年來，大量文獻報道，利用GAP-43 水平反映心肌細胞功能，是判斷交感神經重構常用的指標［13］，故在心衰相關性基礎研究中具有一定作用。本研究結果顯示，心力衰竭模型組大鼠血清GAP-43mRNA、GAP-43蛋白水平較假手術組大鼠血清中上述指標顯著降低，與既往研究報道一致［14］。有文獻報道［15］通過給心力衰竭大鼠灌注益氣活血中藥后較治療前發現血清GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平顯著下降，對心功能指標檢測發現LVEF 提高，大鼠心衰癥狀得到明顯改善。以往研究報道雖給出相同的結論，但并未進一步分析心臟功能與GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平的關系。本研究結果顯示，GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 與LVEF 間均呈負相關。提示，GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 越高，心功能越差。由此可作為心衰病情評估的指標，對臨床診斷和個性化治療方案的確定具有重要意義。

綜上所述，心力衰竭大鼠心臟組織GAP-43mRNA 和蛋白相對表達量明顯下調，與心功能有一定關系，在疾病發生發展中有重要作用。本研究創新處，不僅確定GAP-43蛋白、GAP-43mRNA水平在心衰診斷中的價值，還得出其與心功能的關系，對臨床診治具有重要的指導意義，可推進心衰治療的臨床發展。本研究不足之處，樣本量有限，需擴大樣本進一步深入實驗。