Taq DNA聚合酶5′～3′外切活性對熒光定量PCR的影響

蔣析文 劉靄珊 陳巍

Taqman 法熒光定量PCR 是利用Taq DNA聚合酶（后簡稱Taq 酶）的5′～3′DNA 外切活性，在PCR 過程中切割與模板鏈結合的熒光探針，釋放出熒光基團而產生信號［1］。在反應過程中，Taq DNA聚合酶的聚合酶活性區與5′～3′DNA 外切活性區均參與反應［2-4］。目前Taq 酶標定的濃度為聚合酶活性單位濃度［5-6］，缺乏對5′～3′DNA 外切活性的定量。由于Taqman 探針法熒光定量PCR 信號的產生與Taq 酶的5′～3′DNA 外切活性直接相關，因此本文研究了不同熱啟動Taq 聚合酶的5′～3′DNA 外切酶活性差異，以及該活性對Taqman 探針法熒光定量PCR的影響，以期進一步了解Taq 酶兩種不同活性區在反應中所起的作用，并指導Taqman 法熒光定量PCR 反應的優化。

1 方法

1.1 材料

Taq 酶、Hotstar Taq 酶、HotStar-II Taq 酶均為達安基因制備的原料產品，濃度均為10 U/μL。5′～3′DNA 外切酶活性檢測底物為：Sub1：ATGCTGGTTAAGCTGCCGTAGTCATGCAGTACGTCCGT ACGTCA，Probe1：FAM-CAGCTTAACCAGCATBQH1。外切活性反應buffer（10X）：500 mM Tris、500 mM KCl、20 mM MgCl2、2.5 mM dNTP、pH8.8。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒為達安基因產品。

1.2 方法

1.2.1 5′～3′DNA 外切酶活性的測定

酶樣品用保存液進行梯度稀釋：5、4、3、2、1、0 U/μL，反應體系見表1。

表1 5′～3′DNA 外切酶活性測定反應體系Table 1 The Reaction of 5′～3′exonuclease activity assay

反應體系放置于Q5 熒光定量PCR 儀中，設置熒光檢測通道為FAM，設置反應程序：95℃10 min，（95℃10 s，55℃30 s 并讀取熒光）X 40 個循環。反應后將原始熒光數據導出，以熒光強度（relative fluorescence units，RFU）為縱坐標，反應時間（min）為橫坐標作圖，得到在各濃度下的外切酶反應動力學曲線。計算反應前期的RFU 值線性增長部分（線性R2＞0.9）的斜率，即為各聚合酶濃度梯度下外切酶活性測試的反應速率（RFU/min）。

1.2.2 不同酶的5′～3′DNA 外切酶活性的對比

根據1.2 測定的同一個聚合酶在不同聚合酶活性濃度下的外切酶活性反應速率，以反應速率為縱坐標，聚合酶活性濃度（U/μL）為橫坐標作圖，得線性關系方程，方程的斜率即為在單位聚合酶活性濃度下所具有的外切酶活性。對比不同酶所作線性關系方程的斜率，即可計算其外切酶活性的差異倍數。

1.2.3 不同酶在HBV 病毒DNA 熒光定量PCR 反應體系中的性能測試

取達安HBV 病毒DNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒，按照使用說明書的方法進行陽性參照品的提取制備。將酶樣品稀釋至1 U/μL，然后按使用說明每反應加入27 μL 反應液A 及3 μL 的1 U/μL酶樣品，混合均勻后加入20 μL 陽性參照樣品提取物。按95℃10 min，（95℃10 s，55℃30 s 并讀取熒光）×40 個循環，進行PCR 反應。

2 結果

2.1 5′～3′DNA 外切酶活性的測定

5′～3′ DNA 外切酶活性的測定原理如圖1。Taq 聚合酶的5′～3′DNA 外切酶活性不依賴于上游的模板及引物，對交叉DNA 或雙鏈DNA 的5′游離末端具有特異性因此設計與單鏈DNA（Sub1）互補的探針（Probe1），探針5′端標記FAM 熒光，3′端標記BQH1 淬滅基團，當Taq 聚合酶5′～3′DNA 外切活性降解Probe1 時，FAM 熒光基團從探針脫離，發出熒光信號，通過實時熒光定量PCR 儀可檢測出反應曲線（圖2）。從圖2 可見，隨著聚合酶濃度的下降，反應曲線的斜率隨之下降，反應曲線前期熒光線性增長區的斜率即為各濃度梯度下反應速率。從圖3 可見，反應的初始速率與加入的聚合酶濃度成線性關系（r2=0.982），此直線的斜率可衡量單位濃度的Taq 酶所具有的5′～3′DNA 外切活性高低。

圖1 5′～3′DNA 外切酶活性測定原理Figure 1 Schematic of 5′～3′exonuclease activity assay

圖2 不同濃度的Taq 酶與底物反應后的熒光曲線Figure 2 Fluorescence curve of substrate reaction with gradient of Taq

圖3 Taq 酶濃度與其5′～3′DNA 外切活性的線性關系Figure 3 Linear relationship between the concentration of Taq and its 5′～3′exonuclease

2.1 不同熱啟動Taq 酶的5′～3′DNA 外切活性的對比

兩種熱啟動酶Hotstar Taq 和Hotstar-II Taq 來源于Taq 酶，經不同化學修飾方法制備而成。測定3 種酶在相同濃度下的5′～3′DNA 外切活性，結果見圖4。

圖4 Hotstar Taq、Hotstar-II Taq、Taq 酶在相同聚合酶活性濃度下的5′～3′外切活性的對比Figure 4 comparison of 5～3′exonuclease activity of Hotstar Taq、Hotstar-II Taq、Taq with the same polymerase activity

從圖4 可見，未經化學修飾的Taq 酶同等聚合酶活性濃度下具有最高5′～3′外切活性，而經過化學修飾的制備而成的Hotstar Taq 及Hotstar-II Taq的5′～3′外切活性均有所下降，其中Hoststar Taq 5′～3′外切活性最低。

2.3 熱啟動酶5′～3′ DNA 外切活性對Taqman 探針法熒光定量PCR的影響

使用不同濃度的Hotstar Taq、Hotstar-II Taq 及Taq 酶，對4 個梯度的HBV 陽性參照物（2e6～2e3）進行熒光定量PCR 擴增。結果見圖5。

從圖5 可見，當每反應中加入3 U HotStar Taq、HotStar-II Taq、Taq 酶時，各陽性參照物梯度擴增的情況基本一致，熒光曲線重合；每反應中加入0.38 U、0.19 U 酶時，Taq 酶對各陽性參照物梯度擴增每循環產生的熒光強于HotStar-II Taq，Hot-Star-II Taq 強于HotStar Taq。證明酶對探針的外切反應為PCR 反應的限速步驟。

根據圖4 中測定的各不同Taq 酶單位濃度下的5′～3′ DNA 外切活性（標準曲線方程的斜率），Taq 酶的外切活性為HotStar-II Taq 的2.70 倍，Hot-Star Taq 的4.55 倍，調整PCR 反應中酶的用量至反應中加入的5′～3′外切酶活性單位一致（Taq：0.38 U/反應，HotSatr Taq：1.73 U/反應，HotStar-II Taq 1.03 U/反應），測試對HBV 陽性參照物樣品的擴增效率，結果見圖6。從圖6 可見，即使各酶加入量不同，但擴增曲線基本一致，證明當反應中5′～3′外切酶活性一致時，增加聚合酶活性并沒能進一步提高PCR的擴增效率，因此進一步證明了酶對探針的外切反應為PCR 反應的限速步驟。

圖5 3 種聚合酶活性不同活性梯度下對HBV 陽性參照物的測試結果Figure 5 Amplification of HBV positive sample by three polymerases with equal activity unit

圖6 3 種聚合酶擴增不同梯度HBV 陽性參照物的測試結果Figure 6 Amplification of gradient HBV positive sample by three polymerases with different activity unit

3 討論

Taqman 探針法實時熒光定量PCR 是當今分子診斷的主流技術，以其快速、高通量［7］、多通道［8］、高靈敏度［1，9］、高特異性［2］等特點，被廣泛應用于病原微生物的定性及定量檢測［10-12］、單核苷酸多 態（Single nucleotide polymorphism，SNP）檢測［13-14］、短串聯重復序列（Short Tandem Repeat，STR）分型檢測［15］、基因表達水平差異檢測［16］、等位基因表達差異檢測（Allelic Expression Imbalance，AEI）［17］、融合基因檢測［4］等方面，在科研、臨床診斷、疾病防控、獸醫、法醫、檢驗檢疫等領域有著廣闊的應用前景。其檢測原理是：具有5′～3′DNA 外切活性的DNA聚合酶在PCR 延伸過程中遇到結合在模板鏈上的熒光標記探針時，利用其5′～3′DNA 外切活性將探針降解，釋放熒光信號并由實時定量PCR 儀檢測［5］。根據此原理，Taqman探針法熒光定量PCR 檢測的信號與PCR 產物的擴增及探針的切割直接相關。在Taq DNA聚合酶上，聚合酶活性區與5′～3′DNA 外切活性區位于不同的結構域［15］，聚合活性區與外切活性區共同作用，驅動新生DNA 鏈合成的同時切割熒光探針釋放信號。在聚合與外切兩種不同的反應中，反應效率低的一方直接決定DNA 擴增的效率以及熒光信號釋放的效率。根據報道，Taq 酶并非完全降解探針，其降解的區域從探針的5′端起約5～12 bp，未完全降解的探針有可能參與后續的PCR 循環，從而抑制熒光信號的釋放，而探針的降解與Taq 酶的外切活性的強弱密切相關［3，18］。從本研究所得結果可見，當反應中酶過量時（3 U/反應），聚合酶活性及外切酶活性同時滿足反應的需求，不同酶之間擴增效率沒有明顯差異。但在酶量不足的情況下（0.38、0.19 U/反應），反應中加入相同聚合酶活性的Taq 酶，具有更高外切酶活性的酶其擴增效率更高；而加入相同外切酶活性的Taq 酶，即使聚合酶活性不同，但擴增效率基本一致。以上結果證明外切反應為限速步驟，其速率決定DNA擴增的效率。

提高Taq 酶的DNA 聚合活性及持續延伸能力是改進PCR 效率的一貫策略，但由于Taqman 探針法熒光定量PCR的信號產生依賴于探針的降解，而本研究揭示了Taq 酶5′～3′ DNA 外切活性與PCR 熒光信號的關系，為Taq 酶的性能改造指出了新的方向。為提高PCR 特異性，均需要對Taq酶的活性位點進行封閉修飾從而達到熱啟動的目的。化學修飾由于成本較低，能在較高溫度下保持封閉，是對Taq 酶進行熱啟動修飾的較常用方法。但化學修飾不可避免地對Taq 酶的結構和活性有影響，在修飾過程中會出現蛋白變性、沉淀和失活，被修飾基團在酶上各結構域分布的情況也可能影響各結構域在修飾后性能改變的程度［19］。本研究中兩種不同化學修飾制備的Taq 酶表現出不同的外切酶活性和PCR 擴增性能也證明了這一弊端。抗體修飾Taq 酶或配體修飾Taq 酶由于通過與Taq酶結合而屏蔽活性位點達到熱啟動的目的［20-21］，因此能保留Taq 酶完整的活性。在耐熱DNA聚合酶的突變改造中，突變篩選方法通常專注于提高聚合酶性能而忽視對外切酶性能的考察［6，22-23］，而抑制或刪除5′～3′外切活性結構域已被證明是提高聚合酶性能的有效途徑［25］，因此篩選出的突變體很可能因外切酶活性低而不適用于Taqman 探針法定量PCR。為解決這一問題，有必要在篩選前確認突變體具有完整的外切活性功能。