海南地區(qū)571例男性感染HPV的基因型分布特點(diǎn)研究

呂家慶 胡俊杰 符生苗 陳鑫蘋(píng)★

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）主要通過(guò)性接觸傳播，一般夫妻或性伴侶雙方共同發(fā)病。女性感染部位主要分布在宮頸、外陰、陰道和肛門(mén)，可導(dǎo)致良性乳頭狀瘤或無(wú)乳頭狀瘤等臨床癥狀，男性除在肛周區(qū)域和外生殖器（包括包皮、陰囊、龜頭和陰莖）外，尿道、輸精管、附睪和睪丸等部位也會(huì)發(fā)生感染。與女性感染不同，男性感染高危型HPV 通常無(wú)明顯癥狀，并且男性感染后不僅有癌變風(fēng)險(xiǎn)還可能會(huì)導(dǎo)致男性不育癥的發(fā)生［1］。臨床研究表明女性因HPV感染導(dǎo)致患宮頸癌（cervical cancer）的風(fēng)險(xiǎn)明顯受到男性性行為的顯著影響，在實(shí)際調(diào)查中男性感染HPV的現(xiàn)象越來(lái)越普遍，導(dǎo)致女性高風(fēng)險(xiǎn)HPV 相關(guān)癌癥和癌前病變的發(fā)病率增加，因此研究男性HPV感染類(lèi)型對(duì)女性宮頸癌的預(yù)防和康復(fù)治療都至關(guān)重要［2］。本研究對(duì)571例男性感染者的HPV 基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以明確HPV 基因型在男性感染者中的分布特征，減少男性感染者的傳播途徑，并降低HPV相關(guān)癌變風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

對(duì)2014年8月至2018年2月間于海南省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行HPV 基因分型檢測(cè)并確診的571例男性患者，年齡范圍為16～76 歲，平均年齡（35±9）歲結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有待檢樣本取自男性患者外生殖器的包皮、冠狀溝、尿道口及肛周的組織脫落細(xì)胞或分泌物，使用一次性生殖道拭子（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）采集后立即送檢，低溫保存運(yùn)送，采集管內(nèi)樣本4℃保存不超過(guò)7 天，-20℃保存不超過(guò)3 個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

1.2 主要試劑和儀器

亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒基因分型（23 型）檢測(cè)試劑盒（主要組成成份：反應(yīng)液Ⅰ和反應(yīng)液Ⅱ、陰陽(yáng)質(zhì)控品、膜條、裂解液、鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺）以及YN-H16 型恒溫雜交儀，T100 Thermal Cycler 型基因擴(kuò)增儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA 分離提取

取出保存有組織脫落細(xì)胞或分泌物的細(xì)胞保存液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，13 000 rpm 離心10 min，棄上清液后，利用細(xì)胞裂解液（分離法）提取DNA。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增

分別向裝有反應(yīng)液Ⅰ和反應(yīng)液Ⅱ的PCR 反應(yīng)管（規(guī)格為20 μL/管）中分別加入5 μL 抽提好的DNA，擴(kuò)增總反應(yīng)體系均為25 μL/反應(yīng)。設(shè)置反應(yīng)條件：50℃15 min；95℃10 min，94℃30 s，42℃90 s，72℃30 s 共40 個(gè)循環(huán)；72℃5 min。

1.3.3 HPV 基因分型

用人乳頭狀瘤病毒基因分型檢測(cè)試劑盒（PCR-反向點(diǎn)雜交法）檢測(cè)23 種HPV 亞型：6、11、42、43和81（5 種低危亞型）；16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82 和83（18 種高危亞型）。主要原理是采用PCR 體外擴(kuò)增和DNA反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的HPV 基因分型檢測(cè)技術(shù)，利用HPV的基因特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增出23 種HPV 基因型的目的片段后，再將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在膜條上的分型探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)的有無(wú)來(lái)判讀結(jié)果。變性產(chǎn)物通過(guò)冰盒轉(zhuǎn)移至離心管中并加入雜交液，先沸水浴10 min，再放入雜交箱51℃雜交1.5 h，洗膜和顯色后，按照試劑的判讀標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)陰、陽(yáng)性質(zhì)控品均進(jìn)行同步處理以作對(duì)照。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單一感染組和多重感染組中各基因亞型頻率用%表示、不同年齡段感染HPV的危險(xiǎn)類(lèi)型以及不同危險(xiǎn)類(lèi)型的感染類(lèi)型的組間使用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV 各亞型頻率分布

低危型感染較高的基因型有：6 型202（35.38%）、11 型109（19.09%）、42 型58（10.16%）；高危型感染率較高的基因型有：52 型76（13.31%）、51 型65（11.38%）、16 型63（11.03%），見(jiàn)表1。單一感染和多重感染（見(jiàn)圖1）中HPV 各亞型對(duì)比分析顯示，多重感染均高于單一感染差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.2 不同年齡段感染HPV的危險(xiǎn)類(lèi)型

571例男性HPV感染者中，單純低危型感染率為38.18%，單純高危型感染率為34.15%，高低危混合型感染率為27.67%，2 組間感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但2 組的感染率均高于高低危混合型組（P＜0.05）。不同年齡組之間HPV感染率總體比較，21～30 歲組和31～40 歲組的HPV感染率最高（P＜0.05），分別為33.98%和34.15%。不同感染類(lèi)型的各年齡段之間HPV感染率比較，單純低危型中21～30 歲組和31～40 歲組感染率最高（P＜0.05），均為13.84%，2 組間比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；單純高危型中31～40 歲組的感染率為12.61%，高于其它年齡組（P＜0.05）；高低危混合型中21～30 歲組的感染率為10.16%，高于其它年齡組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 HPV 各亞型分布情況［n（%）］Table 1 Frequency distribution of HPV subtype［n（%）］

圖1 不同感染類(lèi)型的基因檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Genetic test results for different infection types

2.3 不同HPV感染類(lèi)型分布

不同感染類(lèi)型中單一感染有322 人，占56.39%，多重感染有249 人，占43.61%，單一感染的感染率高于多重感染（P＜0.05）。隨著感染重?cái)?shù)的增加，單純低危型、單純高危型和高低危混合型的感染率均呈下降趨勢(shì)（見(jiàn)圖3），其中單一感染中，單純低危型占31.17%，單純高危型占25.22%，單純低危型感染率高于單純高危型（P＜0.05）；多重感染中，二重感染和三重感染的感染率最高，分別為25.22%和9.98%，且高低危混合型組感染率高于單純低危型組或單純高危型組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

圖2 單一感染和多重感染中HPV 各亞型頻率分布Figure 2 Distribution of HPV subtypes in single infection and multiple infections

表2 不同年齡段感染HPV的危險(xiǎn)類(lèi)型［n（%）］Table 2 Types of hazards infected with HPV at different ages［n（%）］

圖3 不同感染類(lèi)型的感染率分布情況Figure 3 Distribution of infection rates for different infection types

表3 不同HPV感染類(lèi)型分布n（%）Table 3 Distribution of different HPV infection types n（%）

3 討論

HPV 是一類(lèi)嗜上皮性的雙鏈DNA 病毒，已經(jīng)確定的HPV 基因型達(dá)200 多種，根據(jù)其致癌性將粘膜型HPV 分為高風(fēng)險(xiǎn)型（high risk，HR）和低風(fēng)險(xiǎn)（low risk，LR）型，而HR-HPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致正常上皮轉(zhuǎn)變?yōu)榘┣安∽兒桶┳兊闹饕颍?］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，宮頸癌和其他肛門(mén)生殖器癌癥的發(fā)生率約占全球癌癥總發(fā)生率的5%，并且已經(jīng)證實(shí)這類(lèi)疾病與HR-HPV感染密切相關(guān)［4］。此外研究資料還顯示全世界約70%的宮頸癌患者是由HPV16 和HPV18感染引發(fā)，約60%的口咽癌發(fā)生是與HPV16 和宿主細(xì)胞染色體整合造成持續(xù)性感染有關(guān)［5］。

近年來(lái)，隨著高特異性HPV 基因分型檢測(cè)技術(shù)的推廣，HPV感染檢出率逐漸上升，但由于地區(qū)、人口組成、采樣周期和測(cè)試方法的差異，導(dǎo)致研究結(jié)果可能存在偏差。LR-HPV感染分布中，本研究結(jié)果顯示HPV6 和HPV11 感染頻率分別為35.38%和19.09%，為男性群體中主要的LR-HPV感染類(lèi)型，與黃澤棋等人［6］在廣東地區(qū)的研究顯示HPV6 和HPV11 為主要感染基因型的研究結(jié)論相似。而與LR-HPV感染相關(guān)的許多良性皮膚疣、粘膜病變和低度宮頸上皮內(nèi)病變都會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)大的健康負(fù)擔(dān)［7］。HR-HPV感染分布中，田欣欣等人報(bào)道HPV16、52、58 和18 是國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)男性群體中主要的HR-HPV 類(lèi)型，其中HPV16 被發(fā)現(xiàn)與異常細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的關(guān)聯(lián)度最高，其次是HPV58、18、52，并且感染類(lèi)型和感染率存在區(qū)域差異性［8］。本研究結(jié)果中HPV16、52、58 和18 的感染率依次為11.03%、13.31%、7.71%和4.20%，其中HPV16 和HPV52 的感染率最高，且多重感染類(lèi)型中HPV 各亞型頻率均高于單一感染，與田欣欣的研究結(jié)果比較本研究中男性HPV 多重感染中各亞型分布具有范圍廣、基因型復(fù)合程度和攜帶率較高等特點(diǎn)。不同年齡段的HPV感染結(jié)果顯示，≤20 歲組中呈現(xiàn)初始的感染狀態(tài)，21～40 歲組中感染率最高，40歲以上組感染率呈下降趨勢(shì)，此結(jié)果可能與21～40歲組男性處于性生活活躍期而導(dǎo)致HPV感染幾率增加有關(guān)。據(jù)報(bào)道［9］由HPV 引起的宮頸癌是中低收入國(guó)家孕期婦女（年齡為20～40 歲）發(fā)病率和死亡率的主要原因，每年約有50 萬(wàn)新病例和266 000人死亡，處于性活躍期的男性群體增加了HPV 通過(guò)性傳播途徑傳染給女性的可能。此外21～60 歲組中HPV 高危型（包括單純高危型和高低危混合型）攜帶率高于單純低危型，表明男性人群中HRHPV感染較為常見(jiàn)，這不僅增加了自身癌變的潛在風(fēng)險(xiǎn)同時(shí)也增加了其性伴侶的感染和癌變機(jī)率。

雖然多重感染影響生存的具體原因還不完全清楚，但多種HPV 基因型的存在可能增加持續(xù)性感染的長(zhǎng)度和致癌風(fēng)險(xiǎn)。所以HPV 多重感染的流行特征對(duì)宮頸癌的發(fā)生以及持續(xù)感染患者的預(yù)后有重要意義，通過(guò)HPV 基因分型檢測(cè)可以對(duì)患者的生存質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測(cè)［10］。本研究男性感染者中二重感染和三重感染的人數(shù)最多，并且隨著感染重?cái)?shù)的增加，不同類(lèi)型的感染率均呈下降趨勢(shì)。此外高低危混合型組感染率高于單純低危型組或單純高危型組，表明男性HPV 多重感染中以高低危混合型為主且感染譜較廣，可能增加CA 和高度癌前病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)以致對(duì)患者的治療及預(yù)后產(chǎn)生影響。

用HPV 疫苗進(jìn)行大規(guī)模免疫接種能夠降低HPV感染率，自2007年以來(lái)國(guó)外許多中低收入國(guó)家已經(jīng)通過(guò)HPV 疫苗接種試點(diǎn)，同時(shí)許多示范項(xiàng)目和國(guó)家項(xiàng)目都獲得了HPV 疫苗接種經(jīng)驗(yàn)［11-12］。研究報(bào)道目前還沒(méi)有較為成熟的男性HPV 相關(guān)癌癥的篩查方案，而男性感染者往往會(huì)增加前列腺癌、肛門(mén)癌和口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)，尤其男男性接觸者的發(fā)病率明顯高于其他人［13-15］。雖然各國(guó)正試圖將HPV 疫苗擴(kuò)大到男性人群中使用，且有研究報(bào)道［16］HPV 疫苗接種對(duì)男性具有保護(hù)作用，但監(jiān)測(cè)HPV疫苗對(duì)男性癌癥發(fā)病率的影響將需要相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間觀察。而HPV感染導(dǎo)致的非宮頸癌有關(guān)癌癥往往其發(fā)病中位年齡較大，同時(shí)在樣本規(guī)范收集和不同人群診斷和篩查等方面也面臨較多困難，所以給男性HPV 疫苗接種研究帶來(lái)阻礙［17］。例如Tatar 等人［18］進(jìn)行的一項(xiàng)加拿大大學(xué)生（主要為男性群體）對(duì)接種HPV 疫苗的認(rèn)識(shí)調(diào)查中，結(jié)果顯示研究對(duì)象中大多數(shù)人并不知道HPV 疫苗能給予男性使用，也均未接種過(guò)男性HPV 疫苗，該群體的調(diào)查結(jié)果尚且如此，其他男性群體的了解程度可能會(huì)更低。本研究結(jié)果為男性群體的HPV 檢測(cè)、治療和疫苗接種提供了流行病學(xué)依據(jù)，對(duì)降低男性HPV感染率和癌變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有一定的參考價(jià)值。