WGA、RDB結合STR單體型分析在β-地中海貧血胚胎植入前遺傳學診斷中的應用

李伍高 嚴提珍 李哲濤 唐永梅 秦祖興 李忻琳 蔡稔★

β-地中海貧血（β-thalassemia，簡稱“β-地貧”），是一組全球最常見、對人類健康影響最大的常染色體單基因隱性遺傳病之一。在中國，多發于南部沿海地區，其中以廣西、海南、廣東常見，分子流行性病學調查結果顯示廣西β-地貧致病基因攜帶率為6.43%［1］。β-地貧分為點突變型和缺失型，以點突變型最為常見。

目前預防和控制地貧的診斷方法包括傳統產前診斷和植入前遺傳學診斷（Preimplantation Genetic diagnosis，PGD）。前者是在不同孕周進行絨毛膜取絨毛或羊膜腔穿刺抽取羊水或臍帶血等方法對已孕胚胎進行基因診斷，而PGD 是將常規產前診斷提早到胚胎于子宮著床之前進行活檢和遺傳學分析，選擇無遺傳性疾病的胚胎植入子宮腔內，從而獲得正常胎兒的診斷方法。目前應用于β-地貧PGD 的方法包括：巢式PCR 結合變性梯度凝膠電泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）分析技術［2］、應用引物延伸預擴增方法［3］、全基因組擴增技術（whole genome amplification，WGA）［4］、單細胞巢式PCR 技術［5-7，16］、Taq-Man-MGB 探針實時熒光PCR 技術［8］、突變擴增系統（amplification refractory mutation system，ARMS）技術［9］、熒光共振能量轉移雜交探針實時PCR 技術［10］、多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）結合巢式PCR 技術［11］、短串聯重復（short tandem repeat，STR）序列單體型分析技術［12-13］、熒光PCR 、技術［14-15］。希臘［2］、印度［9］、臺灣［10］、新加坡［12］、伊朗［13-15］、意大利［16］、中國［3-8，11］都有β-地貧PGD 的成功案例。近幾年國內學者利用胚胎培養基成功進行β-地貧IVS-II 654 突變的無創植入前胚胎遺傳學檢測［17］。本研究分析2017年1月至2018年12月在本院進行β-地貧PGD 的周期資料，探討WGA 結合致病位點檢測和STR 序列單體型分析進行β-地貧PGD 的效果。

1 材料和方法

1.1 研究對象

分析本中心2017年1月至2018年12月進行β-地中海貧血PGD 的檢測資料，納入研究71 個檢測周期合計501 個胚胎，該項目通過柳州市婦幼保健院生殖醫學倫理委員會批準（20170221029），且每對夫婦均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 STR 位點的鑒定和選擇

利用UniSTS 和UCSC 數據庫選擇15 個與β-珠蛋白基因緊密關聯的STR 標記（HBB4506、D11S988、HBB4677、D11S2362、HBB5089、D11S1243、HBB5138、HBB5178、HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D11S1338）。為提高診斷的準確性和減少人工stutter 峰的干擾，所有選擇的STR 位點均為三核苷酸或四核苷酸重復，用Oligo7.56 軟件設計STR 序列引物，由生工生物（上海）股份有限公司合成。隨后，對260 例無血緣關系的健康個體進行基因分型，以評估每個STR 位點的基因型頻率。

1.2.2 囊胚滋養外胚層活檢

采取常規排卵方案促排卵，行ICSI 授精，授精后16～18 小時觀察受精情況，取卵后對第5 天囊胚評分為3BB 以上、第6 天囊胚評分為4CB/4BC 以上的胚胎采用激光法打孔，活檢4～10 個滋養層細胞。

1.2.3 全基因組擴增

全基因組擴增試劑盒采用德國QIAGEN 公司的REPLI-g Single Cell Kit。將活檢出的細胞移入PBS 中洗滌3 次，裝入3.5 μL PBS 緩沖液200 μL PCR 管中，同時取最后一次洗滌的PBS 2 μL 轉入陰性對照管中；加入3.5 μL D2 試劑65℃裂解10 min，冰盒保存加入3.5 μL 終止液，瞬時離心；加入9 μL 超純水，29 μL REPLI-g 反應緩沖液，Polymerase 2 μL，上PCR 儀30℃8 h，95℃5 min，4℃保存，取1.0 μL 產物稀釋100 倍使用。

1.2.4 STR 位點檢測

分為單管15 重，引物100 pmol/μL 等體積混合 備 用，10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 2.5 μL，DMSO 5.0 μL，Hot star Taq（TAKARA，大連）0.5 μL，混合引物4.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 33 μL。95℃預變性5 min；95℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸60 s，共35 個循環；72℃后延伸30 min，12℃保存。

1.2.5 毛細管電泳

利用美國ABI3500Dx 遺傳分析儀進行毛細管電泳，體系：Genescan 500LIZ Size standard（0.5+9.0）μL HI-DI 甲酰胺+1.0 μL PCR 產物；95℃變性5 min，迅速冰浴冷卻5 min。

1.2.6 致病位點檢測

常見位點使用β-地中海貧血基因檢測試劑盒（深圳益生堂）進行反向點雜交（reverse dot blot，RDB）檢測，按說明書操作，罕見位點利用Sanger 測序檢測，外送上海立菲生物技術有限公司。

1.2.7 胚胎移植均為單囊胚移植，專人負責隨訪。

2 結果

2.1 15 個STR 位點的雜合度情況

根據各STR 位點觀察到的等位基因數及等位基因頻率，發現D11S1243 雜合度最高，為0.90；最低為HBB5178，為0.62，15 個STR 位點雜合度高，適合應用于β-地中海貧血胚胎植入前遺傳學檢測的單體型構建。見表1。

表1 15 個STR 位點的雜合度Table 1 Heterozygosity of 15 STR loci

2.2 β-地貧PGD 的結果

71 個周期501 枚囊胚基因檢測結果及部分家系STR單倍型分析結果。中69 對夫妻進行了移植，移植周期92 個，生化妊娠率63.04%，臨床妊娠率53.26%，合計45 對夫婦進行了產前診斷或流產物分析，與胚胎檢測結果一致性為100%。見表2，圖1。

Ⅰ-1（父親）β-28突變攜帶者，Ⅰ-2（母親）為β41-42突變攜帶者，有6 個囊胚，其中Ⅱ-1（胚胎1）為未攜帶突變的正常胚胎，Ⅱ-2（胚胎2）和Ⅱ-5（胚胎5）的STR 結果分別提示可能為單體和三體，Ⅱ-3（胚胎3）為β41-42突變攜帶者，Ⅱ-4（胚胎4）和Ⅱ-6（胚胎6）為β-28/β41-42復合雜合突變地貧胚胎。

表2 71 個周期501 枚囊胚基因檢測結果Table 2 The results of 501 blastocyst gene test in 71 cycles

圖1 部分家系STR單倍型分析結果Figure 1 STR haplotypes analysis in some families

3 討論

隨著分子生物學技術飛速發展，越來越多的檢測技術應用到胚胎植入前遺傳學診斷。但是不可避免出現單細胞PCR 產物少、擴增失敗、等位基因脫扣（allele drop out，ADO）等問題，故歐洲人類生殖與胚胎學學會（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）推薦DNA 擴增引物設計中除了致病基因之外，還應包括相鄰的相關及不相關位點，通過高度多態性標志物的分析，可以判斷外源性DNA 污染及ADO，從而提高單基因病PGD 準確率［18］。WGA 結合PCR 及其衍生的PCR 技術、STR 位點單體型構建成本低廉，可給需要進行PGD 治療的患者降低經濟負擔，而且誤診率低、檢測成功率高，能滿足日常的臨床檢測需求，故應用廣泛。

目前WGA 技術主要有四種：簡并寡核苷酸引物PCR 擴增（Degenerate oligonucleotide primer-PCR，DOP-PCR）、多重置換擴增（MDA）、置換預擴增和PCR 擴增的組合（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）和轉座子插入線性擴增（Linear Amplification with Transposon Insertion，LIANTI）［19-20］。WGA 技術通過非選擇性地擴增活檢的滋養外胚層細胞的整個基因組DNA，在真實反映基因組全貌的基礎上最大限度地增加其DNA 量，為后續分析提供足量的DNA模板［19］，在單體型構建方面，我們應用的是短串聯重復序列，目前應用于β-地貧胚胎植入前遺傳學檢測的STR 位點較少［13，15］，而且由于雜合度問題，選擇的STR 位點不是每個點都能應用到單體型構建來分析胚胎檢測結果。這就使得實際上每對進行PGD 的夫婦所用得到的STR 位點更加少，造成胚胎檢測結果不明確風險增加，更多的時候需要增加STR 位點來進行檢測［12］，本研究選擇的15 個STR 位點雜合度均超過0.5，能滿足單體型構建。

β-地貧是常見的常染色體隱形遺傳病，符合經典的孟德爾遺傳規律，正常：攜帶：重型比例約為1∶2∶1。在本研究結果中，正常比例21.35%（101/473），攜帶者比例49.05%（232/473），重型β-地貧比例23.89%（113/473），約為1∶2∶1，符合孟德爾遺傳規律，可間接的證明該檢測技術的安全性。

在進行胚胎移植過程中，筆者優先選擇移植正常胚胎，攜帶者胚胎次之，如無胚胎可移植的情況下選擇致病位點檢測為正常或攜帶者而STR 提示重組的胚胎；重型β-地貧和STR 提示11 號染色體發生拷貝數變異的胚胎不考慮移植，均進行單囊胚移植。

通過檢測結果較符合孟德爾遺傳規律，而且產前診斷符合率高，雖然越來越多的技術應用到β-地貧植入前遺傳學診斷，但是利用全基因組擴增結合STR單體型分析和致病位點進行β-地貧胚胎植入前遺傳診斷仍不失為一種不錯的選擇。