豬MBL2 基因序列特征分析

馬 越，彭 帥，陳 朗，王馨敏，劉麗霞*

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

甘露聚糖結合凝集素（mannanbinding lectin, MLB）它的別名是甘露聚糖結合蛋白，膠凝素家族的成員中就有它的存在。MBL的本質是糖蛋白，由肝臟細胞合成MBL后進入到血液循環中的基因。MBL在機體天然免疫防御系統中有重要的意義，提高機體的抗病性必須要保證MBL在體內的濃度有著較高的水平才能達所需目的。甘露聚糖結合凝集素2（mannanbindinglectin2,MLB2）基因是MBL基因的一種，豬的MBL2基因位于14號染色體，有4個外顯子和2個內含子[1]。研究表明MBL2在控制豬的疾病方面有很重要的作用，通過使用同源建模和折疊識別的方法可以構建MBL2蛋白的結構進而研究出兩個蛋白質之間相互作用情況，進而有效地控制異種病毒的傳播[2]。程少文等[3]研究通過構建MBL2蛋白與MASPS家族蛋白質的結構得到MBL2基因在補體系統激活及機體免疫防御等方面發揮重要的作用。夏銘崎等[4]研究表明免疫疫苗也可以控制PRRS的致病性，通過將基礎種子接種到患有豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）健康且易感染的仔豬，在豬體內連續傳五代以驗證毒力返強風險是否存在于該疫苗株中。通過構建載體得到重組蛋白進而建立試劑盒用以檢測PRRSV血清抗體，結果表明血清抗體與豬病毒性傳染病特異性良好，可有效用于流行性病毒的研究[5]。劉玉芬等[6]研究表明哈白豬MBL與人類MBL在功能上的相似性，可以為用豬MBL代替人MBL來治愈患有甘露聚糖結合凝集素缺陷的人類疾病提供條件基礎。袁焰平等[7]研究表明PRRS與MBL2基因有關連，PRRS屬于動脈炎病毒屬，可以使懷孕母豬流產、死胎甚至影響后代，為進一步研究豬藍耳病提供了有力的依據。

近年來傳染病對豬的危害范圍越來越廣泛，包括外界因素和自身等因素，然而豬繁殖與呼吸綜合征是目前養豬業危害最大、控制最難的傳染病之一。因此，近年來有關豬繁殖與呼吸綜合征的防治、抗病育種和提高豬自身抗病力正在進行進一步的研究。該研究利用生物信息學分析的方法得出結論，可為MBL2基因作用機理的深入研究與控制豬的疾病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 豬MBL2基因序列

從GenBank中查找已公布的豬MBL2基因編碼區全長序列（登錄號：NM_214125.1）。

1.2 生物信息學分析

對豬的MBL2基因CDS區編碼蛋白的氨基酸序列進行預測并且分析、對該蛋白質的結構和功能以及理化性質也要進行預測并分析，實驗用的網址和軟件如表1所示。

2 結果與分析

2.1 預測并分析了豬的MBL2基因編碼蛋白質的理化性質

表1 豬MBL2 基因生物信息學主要分析軟件

表2 豬MBL2 基因編碼蛋白質理化特性

利用E x P A S y 的在線程序Protparam預測豬MBL2基因的理化特性，其中包括蛋白質相對分子質量、等電點和氨基酸組成等（如表2）。豬MBL2基因共編碼240個氨基酸，圖1為20種氨基酸所占比例，甘氨酸（GLY）所占比例是最大的，占組成整個氨基酸的12.9%，組氨酸（HIS）、酪氨酸（TYR）和色氨酸（Trp）這3個氨基酸所占比例是最少的，每1個都只占1.2%。基因編碼產物穩定指數為33.35。

2.1 預測并分析出豬的MBL2基因編碼蛋白質的親、疏水性

在計算機上找到E x p a s y 服務器，然后運用該服務器上面的Protscale程序對的豬MBL2基因編碼蛋白質的疏水性警醒預測，結果（圖2）表明此蛋白質第615和616位異亮氨酸（Ile）疏水性為＋1.867，由此可見其疏水性之強，然而位于102位的谷氨酸（Glu），它的親水性為-0.356，我們可以得到它的親水性是最強的。總體平均值為-0.317，所以呈親水性。

2.2 預測并分析出豬的MBL2基因編碼蛋白的N-糖基化位點

通過使用C B S 分析軟件NetNGlyc 1.0對該基因編碼蛋白的N-糖基化位點實行了預測（如圖3）。結果發現，有4個潛在的N-糖基化位點在豬的MBL2基因編碼蛋白質，它們分別是Asn96、Asn260、Asn369以及Asn31。

2.3 豬MBL2基因編碼蛋白質信號肽分析

對豬的MBL2基因編碼蛋白質是否存在信號肽進行了分析，結果如圖4，MBL2基因編碼蛋白質的分值曲線相對典型，其中C值與S值接近0.4，20-21位的氨基酸之間存在切割位點，剪切位點前Y值較高，剪切位點后Y值變低。由此可以判定豬MBL2基因編碼蛋白質存在信號肽。

2.4 預測豬MBL2基因編碼蛋白質二級結構和三級結構及分析

蛋白質的二級結構是指多肽鏈主鏈折疊產生的由主鏈內和主鏈間周期性氫鍵維系的有規則構象為蛋白質的二級結構，這些構象借助各種次級鍵共同構成其三級結構。蛋白質的結構決定其功能，而對蛋白質高級結構的預測和分析對了解蛋白結構與功能之間的相關性有著極其重要的意義。對豬MBL2基因編碼蛋白質二級結構進行預測，結果如圖5，由此可知在二級結構組分中Hh＜45%，Ee＜20%，α-螺旋（Hh）占23.33%，β-折疊（Ee）占13.75%，無規則卷曲(Cc)占62.92%。圖6為其三級結構。

3 討論

近年來有研究表明MBL2基因多態性與豬的肺炎、豬藍耳病、腸道等疾病有關聯。有關報道講述在蛋白質翻譯過程中的速率和蛋白質加工過程中的立體結構可能是因MBL2基因的影響，導致該基因蛋白質功能產生穩定性差異。在豬的多種組織器官中均能發現MBL2基因表達的影響結果，在肝臟中基因的表達量最高，MBL2基因可以合成MBL-C蛋白，多種真菌、細菌、病毒的表面糖基均可以與該基因結合，并通過MBL途徑激活補體啟動機體的天然免疫機制，從而達到殺滅或是清除病原體的作用，另外該蛋白還具有介導免疫調節和吞噬的作用[9-10]。MBL2作為MBL的家族成員之一，MBL與C1有相同的四級結構，可以激活補體、調理吞噬作用，產生強烈的免疫效應。目前國內外已有大量研究表明，大多數動物體內都具有M B L 2 基因，用來編碼M B L-C蛋白，在豬、牛、恒河猴、短尾猴、大鼠、小鼠體內都分離到了MBL蛋白。

研究分析了MBL2基因的結構及功能，通過蛋白質的理化性質、跨膜結構、信號肽、糖基化位點和mRNA二級結構得到相應結果。預測結果可以看出，MBL2蛋白是由240個氨基酸組成的不穩定親水性可溶性蛋白質。豬MBL2蛋白理論等電點為4.97，由此可判斷豬MBL2蛋白是一種酸性蛋白質。豬MBL2蛋白半衰期為30 h，通常蛋白質半衰期越長其結構越穩定，豬MBL2蛋白不穩定指數為33.35，屬于穩定蛋白。依據總平均親水性（-0.317），可判斷豬MBL2蛋白是可溶性蛋白。豬MBL2蛋白無跨膜蛋白結構，可能與MBL2蛋白氨基酸序列較短有關。豬MBL2蛋白具有4個潛在的N-糖基化位點，可能與其抗病性有關聯。mRNA二級結構中無規則卷曲（Cc）占比62.92，因此判斷豬MBL2基因編碼蛋白質二級結構為無規則卷曲型[11-13]。

該研究系統地對豬MBL2蛋白的理化性質及基本結構進行了預測分析，揭示了模式識別受體MBL2理化特性，為深入探究豬MBL2基因的功能、作用機理、抗病育種以及豬藍耳病提供了理論基礎。