Box-Behnken響應面法優化威靈仙飲片的炮制工藝

張永妹， 蔣佳雯， 李 玲， 譚家華， 田源紅， 羅 君*， 殷少文

(1.貴州中醫藥大學 第一附屬醫院， 貴州 貴陽 550001； 2.貴州中醫藥大學， 貴州 貴陽 550001； 3.貴陽市第三人民醫院， 貴州 貴陽 550001)

威靈仙為毛茛科植物威靈仙(ClematischinensisOsbeck)、棉團鐵線蓮(ClematishexapetalaPall.)或東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr.)的干燥根及根莖。威靈仙味辛、咸，性溫，有小毒，歸膀胱經，具有祛風濕、通經絡、消骨鯁等功效，主要用于治療痛風、風濕頑痹、腰膝冷痛、腳氣、癥瘕、積聚、破傷風及諸骨哽咽等癥[1]。其藥理作用研究表明，威靈仙在抗氧化、降血壓、降血糖、免疫抑制、利膽、鎮痛抗炎、抗腫瘤、利尿及松弛平滑肌等方面表現出多種藥理活性[2-5]。

威靈仙飲片在現行版藥典的炮制工藝只有簡單凈制方法，但在全國各省均有地方特色的威靈仙飲片炮制工藝[6]。在貴州，據2005版《貴州省中藥飲片炮制規范》記載的炮制方法為酒潤麩炒[7]，該工藝存在涉及輔料較多、工序操作復雜且無具體工藝參數、炮制品質量參差不齊等問題，且目前未見關于酒潤麩炒威靈仙工藝的研究報道。為此，筆者等采用Box-Behnken響應面試驗設計法，優化威靈仙酒潤麩炒飲片的炮制工藝，明確該炮制工藝參數，擬為貴州省威靈仙酒潤麩炒飲片的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

藥材：威靈仙，購買于同濟堂藥業(批號：20170201；產地：四川)。

試劑：齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，110709-201607，供薄層鑒別和含量測定用)，乙腈(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)，甲醇(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)，水為娃哈哈純凈水，黃酒(酒精度≥16.5%，浙江塔牌紹興酒廠)；甲醇、乙酸乙酯、稀乙醇、乙腈等均為分析純。

儀器：Thermo ultiMate 3000高效液相色譜儀(上海硅儀生化科技有限公司)，AUW 220D十萬分之一電子天平(蘇州島津儀器有限公司)，METTLER TOLEDO ME204E萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，TW-2000W型可控調溫電爐(郫縣永信電器廠)，HH-2數顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)，LDP-150高速多功能粉碎機(浙江永康市紅太陽機電有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 炮制方法 取凈威靈仙段，加適量黃酒拌勻，悶潤一定時間，照麩炒法(附錄一炮制通則)炒至表面淡黃色時取出，篩去蜜麩皮，放涼[6]。

1.2.2 齊墩果酸含量的測定 按照2015版藥典規定，采用高效液相色譜法測定威靈仙中齊墩果酸的含量，作為優化酒潤麩炒威靈仙飲片炮制工藝的評價指標。

1) 色譜條件。色譜柱：WondaSilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。以乙腈∶水=90∶10為流動相進行洗脫，檢測波長為205 nm，柱溫30℃，流速為1 mL/min，進樣體積為10 μL。

2) 標準曲線的繪制及線性范圍。制備濃度為1 mg/mL、0.7 mg/mL、0.64 mg/mL、0.5 mg/mL、0.448 mg/mL、0.33 mg/mL和0.25 mg/mL的齊墩果酸對照品溶液。以相同的體積10 μL依次進樣，按1.2.2的1)項進行測定，以齊墩果酸對照品。溶液濃度(x)為橫坐標，以齊墩果酸峰面積為縱坐標(y)制定標準曲線，得到相應的回歸方程y=118.82x-0.045(R2=0.999 7)，表明齊墩果酸在2.5 ～10.0 μg范圍內線性關系良好。

齊墩果酸含量=[10 000×(y+0.045)]/[(稱樣量×118.82)]×100%

3) 供試品溶液的制備。精密稱取樣品粉末(過四號篩)4 g置于索氏提取器中，加乙酸乙酯適量，加熱回流3 h，棄去乙酸乙酯液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒轉移至錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液25 mL，于99℃水浴上蒸干，殘渣加2 mol/L鹽酸溶液30 mL使溶解，加熱回流2 h。立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10 mL分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振搖提取3次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，70℃以下濃縮至近干，加甲醇溶解，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液[1]。

1.2.3 單因素試驗 根據1.2.1的炮制方法，制備酒潤麩炒威靈仙飲片，在預試驗的基礎上，分別考察黃酒用量、悶潤時間、蜜麩用量、炒制溫度及炒制時間等因素對酒潤麩炒威靈仙飲片中齊墩果酸含量的影響。

1) 黃酒用量。取100 g威靈仙藥材5份，黃酒用量分別為6%、9%、12%、15%和18%，固定悶潤時間為12 h，用12%蜜麩于溫度180℃下炒制10 min取出，篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

2) 悶潤時間。取100 g威靈仙藥材5份，在最佳黃酒用量下，分別悶潤8 h、10 h、12 h、14 h和16 h，用12%蜜麩于溫度180℃下炒制時間10 min取出，篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

3) 蜜麩用量。取100 g威靈仙藥材5份，在最佳黃酒用量及悶潤時間下，蜜麩用量分別為3%、6%、9%、12%和15%，于溫度180℃下炒制10 min取出，篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

4) 炒制溫度。取100 g威靈仙藥材5份，在最佳黃酒用量、悶潤時間及蜜麩用量下分別于140℃、160℃、180℃、200℃和220℃下炒制10 min取出，篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

5 ) 炒制時間。取100 g威靈仙藥材5份，在最佳黃酒用量、悶潤時間、蜜麩用量及炒制溫度下分別炒制6 min、8 min、10 min、12 min和14 min，取出篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

1.2.4 響應面試驗設計 由于不同炒制時間的威靈仙飲片中齊墩果酸含量差異較小，說明該因素對酒潤麩炒威靈仙飲片炮制工藝沒有影響，因此該因素不納入響應面試驗。在參考相關文獻[8-12]及預試驗和單因素試驗考察的基礎上，選擇黃酒用量(A)、悶潤時間(B)、蜜麩用量(C)和炒制溫度(D)為考察因素，根據Box-Behnken的中心組合設計原理，采Design-Expert 8.0.6設計4因素3水平共29個處理的響應面試驗，其中中心點試驗5次重復；以色譜圖中齊墩果酸的含量為響應值對酒潤麩炒威靈仙飲片炮制工藝進行響應面優化，其因素與水平值設置見表1。

表1威靈仙飲片炮制工藝的響應面試驗因素及水平

Table 1 Factor and level of response surface test for processing technology ofC.chinensisdecoction pieces

水平 Level蜜麩用量/% Honey bran dosage黃酒用量/% Rice wine dosage悶潤時間/h Moistening time炒制溫度/℃ Stir-baking temperature-196818001212102001151812220

1.2.5 最佳工藝的驗證 取威靈仙藥材3份，按響應面試驗優選出來的工藝參數進行炮制。并測定齊墩果酸含量。

1.3 數據分析

采用SPSS20.0對數據進行方差分析，Design Expert 8.0.6 對響應面試驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同因素對威靈仙飲片齊墩果酸含量的影響

從表2可知，隨著黃酒用量及蜜麩用量的增加、悶潤時間及炒制時間的延長及炒制溫度的升高齊墩果酸含量均呈先升后降趨勢。黃酒用量、悶潤時間、蜜麩用量、炒制溫度和炒制時間分別為12%、10 h、12%、200℃和14 min的威靈仙飲片齊墩果酸含量在各單因素處理中最高，分別為1.67%、1.70%、1.67%、1.75%和1.67%。

表2 不同因素下威靈仙飲片的齊墩果酸含量

2.2 威靈仙飲片的最佳炮制工藝

2.2.1 二次回歸模型的建立 從表3可知，不同處理威靈仙飲片齊墩果酸含量。對其結果進行二次多項式回歸擬合，得到回歸模型為齊墩果酸含量=1.63-0.023A+0.013B+0.12C-0.016D+0.053AB+0.073AC+0.045AD-0.038BC+0.045BD-0.0075CD+0.028A2+0.13B2-0.29C2+0.072D2(R2=0.911 4)。經方差分析，回歸模型P<0.000 1，說明模型極顯著；失擬項P為0.062 7，不顯著，對模型是有利的，無明顯失擬因素存在，表明該回歸模型的擬合情況良好，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。此外，因素C、B2和C2為顯著影響因素，其P值分別為0.000 3、0.002 2和< 0.000 1，說明對酒潤麩炒威靈仙飲片中齊墩果酸含量影響較顯著，其他項不顯著。

表3 威靈仙飲片炮制工藝各處理的齊墩果酸含量

2.2.2 響應面分析 響應面圖及等高線圖反應2個變量對齊墩果酸含量的交互影響。從圖1～3看出， BC交互的曲線最陡，說明對齊墩果酸含量的影響最顯著； DC交互的曲線稍陡，說明影響較顯著；AC交互的曲線趨于平緩，響應值變化較小，說明影響不顯著。因素間交互作用的影響依次為BC>DC>AC。

2.2.3 最佳工藝及驗證 用Box-Behnken響應面優化法預測最優工藝為蜜麩用量9.6%，黃酒用量6.49%，悶潤10.48 h，炒制溫度為181.5℃，預測含量為1.93%。考慮到實際操作方便，將威靈仙的酒麩制炮制工藝確定為取凈威靈仙藥材，加6%黃酒拌勻，悶潤10 h后，晾干，稱取10%蜜麩、于180℃溫度下炒制，篩去蜜麩皮，放涼，即得。經測定，最佳工藝下3次重復的齊墩果酸含量分別為1.93%、1.89%和1.88%，平均為1.90%。非常接近Box-Behnken響應面優化法預測的含量值(1.93%)，說明優選出來的最佳工藝可靠。

3 結論與討論

根據貴州省2005版的《貴州省中藥飲片炮制規范》的炮制方法威靈仙酒潤麩炒炮制工藝，將該工藝的影響因素暫定為黃酒用量、蜜麩用量、悶潤時間、炒制溫度和炒制時間，采用單因素試驗方法對上述影響因素進行試驗，結果表明，對威靈仙飲片中齊墩果酸含量影響較大的主要有黃酒用量、悶潤時間、蜜麩用量、炒制溫度4個因素，炒制時間對其含量沒有影響，因此不納入該工藝影響因素之內。在進行 Box-Benhnken響應面分析設計時，選擇黃酒用量、悶潤時間、蜜麩用量、炒制溫度4個因素作為考察對象進行Box-Benhnken 4因素3水平的中心組合試驗。

在前期試驗中與傳統的工藝優選方法進行對比研究發現，采用正交或均勻設計進行優化，而這2種設計的方法均是以線性數學模型進行擬合，雖具有試驗次數少的優點，但精確度不高，所建立的數學模型預測性較差。Box-Benhnken響應面分析法采用多元二次方程擬合考察因素和響應值之間的函數關系，可得出影響因素和響應值之間的相互關系，最終優選出最優的工藝參數，該方法進一步提升了精準度，具有試驗次數相對較少，效率更高，可預測的優點。

試驗結果表明，威靈仙飲片的最佳炮制工藝為取凈威靈仙藥材100 g，加黃酒6%拌勻，悶潤10 h后，稱取10%蜜麩、于溫度180℃下炒制，篩去蜜麩皮，放涼，即得。該飲片質量檢測指標符合藥典要求，且驗證性試驗結果也表明，實測值(1.9.%)和預測值(1.93%)非常接近，擬合的數學模型方程相關系數R2=0.911 4，可見，通過Box-Benhnken效應面優化酒潤麩炒威靈仙飲片的炮制工藝方案設計是合理的。