不同促生菌培養發酵分泌的激素和有機酸含量

舒健虹， 王子苑， 劉曉霞， 李亞嬌， 王小利

(貴州省農業科學院 草業研究所， 貴州 貴陽 550006)

磷是植物生命過程最重要的礦物質元素之一，在植物的生長發育和生理代謝活動中起著重要作用[1]。缺少或缺乏磷素，作物不能正常完成其生活史。而植物只有在一個非常窄的土壤pH范圍內才能夠吸收利用磷素，在酸性土壤上，磷和鐵、鋁等金屬元素形成難溶性化合物，在堿性土壤上，磷與鈣、鎂結合從而導致土壤中的總磷含量很高，而作物可利用的磷很少[2]。傳統農業生產中大量施用磷肥，這不僅會導致環境破壞，還因為植物難以吸收利用造成環境的污染。因此，最有效環保的方法是篩選有益菌為植物生長提供磷源。

植物根際促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria， PGPR)是一類存在于植物根際和根表，具有固氮、解磷、產生植物激素等能力，是較好的有益菌群。PGPR中研究最多的是固氮菌和溶磷菌，溶磷菌和固氮菌是影響植物生長發育最重要的土壤微生物，有研究報道，溶磷菌能分泌甲酸、乳酸、丁二酸等多種有機酸促使磷源的轉換供植物吸收利用[3-4]，Rs-5 菌株能夠產生有機酸，菌株產生的檸檬酸和蘋果酸對微生物解磷起主要作用[5]。固氮菌除有固氮功能，還可以促進植物根系的生長，將更多的水分及礦物質輸送到植株地上部分，增加作物的產量[6]。

筆者前期用蛭石+磷礦粉作為基質的盆栽試驗，施用相同處理的Hoagland營養液，在溶磷量差異較大的溶磷菌劑中加入固氮酶活性相同的固氮菌劑，其組合菌劑施入黑麥草根際后，黑麥草植株的磷含量無顯著差異，但干重和植株氮含量差異均顯著。許多學者對此類現象的產生進行了單一菌株分泌激素和有機酸的研究[7]。虞偉斌[8]認為，解磷菌假單胞菌K3主要代謝產物為蘋果酸、乳酸和草酸，有機酸的螯合作用是解磷細菌K3 菌株解磷的主要機理。李宇博等[9]認為，微生物生長繁殖產生草酸為主的有機酸，降低環境的pH，促進難溶性磷的釋放。但對組合菌劑的研究較少。從解磷機理角度加深對功能菌株的認識，充分發揮促生菌株的功能，篩選最佳組合菌劑，具有重要的現實意義。為此，筆者等對不同促生菌進行單株與組合培養，對其分泌激素和有機酸含量進行測定，探尋組合菌劑在激素和有機酸上影響的關鍵因子，以期為復合菌肥研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 試驗所選用的菌種于2017年5-7月分別采自貴州省獨山縣、平塘縣、三都縣和羅甸縣禾本科根際和豆科根際土壤，共分離篩選出48株菌種，用黑麥草作單株回接篩選和組合菌劑試驗，把表現差異較大的2個組合菌劑的菌種進行培養試驗。固氮菌C1分離自白茅根系，菌種特征為菌落透明細小水潤；C2分離自禾本科野草根系，菌種特征為水潤粘稠，邊緣黃褐色；溶磷菌P1分離自葛藤根際土壤，菌種特征為白略透明，干燥；P2分離自白三葉根際土壤，菌種特征為乳白色粘稠。

1.1.2 培養基 促生菌分泌激素、有機酸培養基：1%植酸鈣，2%葡萄糖，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%FeSO4·7H2O，0.001%MnSO4·H2O，2%瓊脂粉，pH 7.0～7.5[10-11]。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 在前期試驗的15個組合試驗中，選用對黑麥草產量和品質促生效果較好的P2+C1組合菌劑和促生效果不明顯的P1+C2組合菌劑，進行單株和組合菌培養試驗，將篩選出的4個菌株設為6個不同的組合處理，分別為C1、C2、P1、P2的單株培養和P2+C1、P1+C2的組合培養，各處理3次重復。將不同組合的菌株接種于促生菌分泌激素、有機酸培養基中培養，9 d后進行內源激素及有機酸含量的測定。

1.2.2 供試菌分泌內源激素及有機酸含量的測定 取培養9 d的菌液，冷卻至4℃，于12 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，用針頭式過濾器濾膜(0.45 μm)過濾于帶有內襯管的樣品瓶內待測。參照郭敏敏等[12]試驗方案，采用高效液相色譜法HPLC (Aglient 1260)測定內源激素〔赤霉素(GA3)、生長素(IAA)、脫落酸(ABA)〕。有機酸測定參照郭燕等[13-14]的試驗方案進行。

1.3 數據處理

采用Excel 2003和SPSS 18.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同促生菌分泌激素的含量

從表1看出，促生菌株沒有產生脫落酸(ABA)，C1分泌的赤霉素(GA3)含量較C2增加82.97%，差異極顯著，生長素(IAA)較C2增加1 895.16%，差異極顯著；P1分泌的GA3較P2增加87.21%，差異極顯著，IAA較P2增加126.74%，差異極顯著；組合菌劑P2+C1分泌的GA3和IAA含量較P2菌劑高100.42%和51 329.51%，差異極顯著，組合菌劑P1+C2分泌的IAA 和GA3含量較P1菌劑低24.81% 和51.45%，且GA3含量差異顯著；分泌激素總含量依次為P2+C1>C1>P1>C2>P2>P1+C2。

表1 不同促生菌培養分泌激素的含量

注：同列不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.01 andP<0.05 level respectively. The same below.

2.2 不同促生菌分泌有機酸的含量

從表2看出，促生菌種分泌有機酸的種類和含量差異很大，菌株分泌總有機酸含量表現為組合菌劑的有機酸含量大于單一菌劑的含量，其總有機酸含量依次為P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。單一固氮菌劑C1分泌的草酸、甲酸、乳酸含量最高，分別為2.73 μg/mL、94.56 μg/mL和334.38 μg/mL。C2分泌的蘋果酸、檸檬酸和丁酸含量最高，分別為58.30 μg/mL、12.93 μg/mL和56.14 μg/mL，總有機酸C1比C2增加30.23%，差異極顯著；P1分泌乳酸、檸檬酸和丁酸含量分別比P2高6.09%、337.68%和651.04%，差異極顯著，總有機酸P1比P2增加29.02%，差異極顯著；組合菌劑P2+C1分泌的檸檬酸、蘋果酸最高，分別為17 856.58 μg/mL和283.71 μg/mL，甲酸次之，為22.93 μg/mL，P1+C2分泌的草酸最高，為3.42 μg/mL，檸檬酸、蘋果酸、甲酸次之，分別為8 314.81 μg/mL、70.72 μg/mL和28.13 μg/mL，其總有機酸含量依次為P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。組合菌劑P2+C1分泌的檸檬酸和蘋果酸含量均高于單一菌劑的分泌量，差異極顯著。P1+C2分泌的檸檬酸、草酸和蘋果酸含量均高于單一菌劑的分泌量，差異極顯著。菌株總有機酸分泌量P1>P2，與其溶磷能力相同。組合菌劑總有機酸P2+C1較P1+C2增加117.19%，差異極顯著。

表2 不同促生菌培養分泌有機酸的含量

3 結論與討論

植物激素能夠普遍調控高等植物的生長發育。生長素是植物體內普遍存在的，也是最早被發現的一類植物激素[12]。IAA 可促進細胞和器官的生長，促進細胞的分裂，引起植物向地性和向光性反應，促進植物雌花分化，誘導單性結實等[13]。當生長素含量降低時植株生長就會受到一定的抑制[14]，在非生物脅迫時參與植物生長發育的調節作用[15]。GA3和IAA 的作用類似，只有在IAA存在的前提條件下GA3才能促進細胞的增大，有增效的作用[16]。赤霉素(Gibberellin，GA)和生長素已被證明在豌豆莖的伸長和單性結實上[17]、楊樹側根的發育[18]、擬南芥花序和根發育[19-20]等方面具有協同作用。試驗中所用菌劑都分泌IAA和GA3，在組合菌劑中P2+C1的激素總含量最高，為155.781 μg/mL，P1+C2總含量最低，為3.967 μg/mL。可見當菌劑達到最佳組合時，其激素含量遠遠大于單一菌劑，這將有利于植物抵抗不利環境的生長和增加生物產量。

有機酸可以不同程度地降低土壤中Fe-P、A1-P 和Ca10-P，增加Ca2-P、Ca8-P含量，促進能力為草酸>檸檬酸>酒石酸[21]。研究認為，微生物風化磷礦石的機理主要是絡合作用、酶解作用、酸化溶解及微生物自然生長的機械作用[22-25]。在磷脅迫條件下，檸檬酸、草酸、酒石酸能夠降低土壤吸附磷的能力，達到解磷的效果[26]。試驗中固氮菌劑分泌的甲酸和乳酸含量最高，草酸次之；溶磷菌劑分泌草酸、乳酸、檸檬酸和蘋果酸，但總有機酸量偏低；組合菌劑P2+C1分泌的檸檬酸、蘋果酸最高，分別為17 856.58 μg/mL和283.71 μg/mL，甲酸次之，為22.93 μg/mL，P1+C2分泌的草酸最高，為3.42 μg/mL，檸檬酸、蘋果酸、甲酸次之，分別為8 314.81 μg/mL、70.72 μg/mL和28.13 μg/mL，其總有機酸含量依次為P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。分泌有機酸是溶磷微生物溶磷的重要途徑之一，但并不是溶磷微生物解磷的唯一的途徑。李小冬等[27]采用轉錄組學解析了白三葉根際溶磷菌株 RW8的溶磷機制發現，菌株生物學過程主要聚類在代謝過程、細胞過程、單細胞過程、刺激應答、定位以及生物反應調節；細胞組分主要聚類在細胞組分、細胞膜、膜組分與高分子配合體等；分子功能主要聚類在催化活性、結合功能與轉運功能，可見溶磷微生物的溶磷過程非常復雜，而不是單一的生物學過程。所以還應開展菌株與環境及寄主之間的溶磷性研究。

促生菌分泌激素組合含量依次為P2+C1>C1>P1>C2>P2>P1+C2，組合菌劑分泌的激素并不是簡單的疊加效應，當組合達到最佳效應時激素的分泌量才能增加。組合菌劑總有機酸含量依次為P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2，但分泌有機酸并不是溶磷微生物解磷的唯一途徑，還應考慮環境因子及寄主對促生菌生長解磷的影響，才能達到植物抗逆增產的作用，試驗中P2+C1是較優組合菌劑。在菌肥的研制上不能簡單的采用疊加方法處理，必須開展大量的組合試驗篩選最佳組合菌劑。