紫杉醇還原敏感膠束凍干粉針制備及溶血研究

于英杰，朱 紅，董 優，宋 煜

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是紅豆杉中的天然活性成分，主要通過誘導和促進微管蛋白聚合，抑制細胞分裂和增殖，發揮抗腫瘤效應，目前廣泛應用于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞性肺癌的治療中［1-2］。由于紫杉醇的水溶性極低（＜1 μg／mL），傳統紫杉醇注射劑Taxol 主要以無水乙醇和聚氧乙烯蓖麻油（1∶1）混合溶劑為溶媒，聚氧乙烯蓖麻油具有高致敏性、神經毒性、腎毒性、心臟毒性、易溶血等不良反應，超敏反應發生率高達30%～41%［3-4］，嚴重限制其臨床應用。 白蛋白結合型紫杉醇制劑（Abraxane）解決了紫杉醇難溶性問題，一定程度上改善了傳統制劑增溶劑的超敏反應，但也存在眾多不良反應，如骨髓抑制、神經毒性、胃腸道反應、肝功能異常、肌肉關節痛及脫發等，制約著化療進程和療效［5］。 因此，紫杉醇新型制劑仍需要進一步研究開發。 腫瘤細胞由于代謝異常，導致其細胞內還原型物質谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量增加，是正常組織細胞內環境GSH 濃度的4～10 倍，是細胞外液及循環系統的1 000 倍以上［6］，具有還原響應能力的載藥納米膠束由于能在腫瘤部位快速釋藥，并具有粒徑小、腫瘤靶向性等優點而成為紫杉醇新劑型研究的熱點之一［7-8］。 本課題組以可主動靶向CD44 受體的透明質酸（hyaluronic acid，HA）為親水端，還原敏感二硫鍵為連接臂，甘草次酸為疏水端，通過酰胺反應合成還原敏感型透明質酸-甘草次酸偶聯物（hyaluronic acid-cystamine-glycyrrhetinic acid，HSG），并已成功負載PTX 形成紫杉醇還原敏感型透明質酸-甘草次酸（PTX-HSG）。 本研究旨在制備PTX-HSG 凍干粉針，并初步考察其穩定性和血液相容性，為研制紫杉醇新型制劑提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 試藥 PTX 標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100832-201603）；PTX 原料藥（福建南方制藥股份有限公司，批號：902-1812401）；PTX-HSG（課題組自制）。

1.2 儀器 LC-20AT 儀器高效液相色譜儀（日本島津公司）；380ZLS 激光粒徑測定儀（美國Santa Barbara 公司），ALPHA1-2 LD plus 冷凍干燥機（德國Christ 公司）；UV-9600 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）

2 方法與結果

2.1 PTX 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（75∶25，v／v）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：227 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

2.1.2 標準曲線繪制 精密稱取PTX 10 mg，甲醇溶解，配制200 μg／mL 的貯備液。 采用甲醇梯度稀釋濃度分別為20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg／mL，HPLC 測定峰面積，以峰面積（A）對濃度（C）進行線性回歸，得到標準曲線為A＝38 676C－1 387.5（r＝0.999 9，n＝3），結果表明，在0.5～20.0 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.2 凍干粉針制備 取已載藥膠束原液，加入對應種類凍干保護劑，-20 ℃預凍24 h 后，冷凍干燥，即得載藥膠束凍干粉針。

2.2.1 凍干保護劑篩選 控制凍干保護劑濃度為1%，以凍干品外觀、再分散性及粒徑為考察指標，考察不同種類凍干保護劑（甘露醇、乳糖、葡萄糖）對載藥膠束凍干粉針的影響，結果見表1。 結果表明，PTX-HSG 加入1%葡萄糖作為保護劑時，外觀良好，且易再分散，24 h 內的穩定性良好，粒徑基本不變，故選1%葡萄糖作為PTX-HSG 的凍干保護劑。

表1 不同種類凍干保護劑下PTX-HSG 凍干品的外觀與再分散性（n＝3）

2.2.2 與常用輸液配伍穩定性 取PTX-HSG 凍干品，分別用5%葡萄糖溶液、0.9%生理鹽水溶解，置室溫、自然光下分別于0、12、24 h 取樣，測定粒徑及分布，按“2.1”項下PTX 含量測定方法測定PTX含量變化（0 h 溶液中PTX 含量定為100%）。 結果顯示，5%葡萄糖輸液復溶24 h 內，PTX 含量下降比較緩慢，且粒徑變化不明顯；0.9%氯化鈉輸液復溶24 h 內，PTX 含量下降較明顯，粒徑增大，見表2。因此，用5%葡萄糖注射液作為復溶溶劑，配伍穩定性最好。

表2 PTX-HSG 的配伍穩定性結果（±s，n＝3）

表2 PTX-HSG 的配伍穩定性結果（±s，n＝3）

復溶時間0 h 12 h 24 h粒徑／nm 183.8±1.8 185.5±3.6 187.8±4.6 0.5%葡萄糖 0.9%生理鹽水PTX 含量／%100.0±0.03 99.7±0.01 99.4±0.09粒徑／nm 193.1±4.0 203.9±2.7 225.5±2.2 PTX 含量／%100.0±0.02 96.4±0.01 95.4±0.04

2.2.3 儲存穩定性 取PTX-HSG 納米膠束凍干制劑于4 ℃條件下密封保存，分別在0、1、3、6 月內對PTX 含量、粒徑及分布進行測定。結果見表3，PTXHSG 凍干粉針6 個月內，粒徑和PTX 含量基本不變。

2.3 溶血實驗 取兔血適量于真空采血管中，玻璃棒攪拌除纖維蛋白，加入適量生理鹽水混勻，2 500 r／min 離心10 min，棄去上清，反復洗滌至上清無色。 5%葡萄糖注射液配制2%紅細胞混懸液，待用。取PTX-HSG 凍干粉針適量，5%葡萄糖注射液復溶，稀釋至PTX 濃度為0.5 mg／mL，按表4 中的配制體積，分別加入2%兔紅細胞混懸液和5%葡萄糖注射液，最終配制PTX 濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.075、0.10、0.20 mg／mL，其中9 號管和10 號管分別為0%溶血（A0%）和100%溶血（A100%）。充分搖勻，37 ℃下恒溫水浴1 h 后，3 000 r／min離心10 min，上清液于540 nm 處下測定其吸光度Asample，計算溶血百分數。

表3 凍干PTX-HSG 納米膠束的儲存穩定性（x±s，n＝3）

表4 溶血實驗試劑配制mL

以市售制劑Taxol 作為對照，比較本研究中膠束制劑的安全性，結果見圖1。 結果表明，在0.01～0.2 mg／mL 濃度范圍內，PTX-HSG 載藥膠束相對市售制劑Taxol，溶血百分數略低（均＜2%）。 當溶血性＞5%被認為具溶血作用， 因而此制劑具有良好的血液相容性。

3 討 論

圖1 2 種紫杉醇制劑溶血百分數（n＝3）

凍干粉針劑納米膠束存在于水中，易出現渾濁現象，不利于長期儲存，可通過凍干保護技術將其 制備成凍干粉針，起到長期保存的作用。 有些納米膠束結構穩定性差，冷凍干燥過程中可能改變其理化性質。 因此，需要加入一定量的凍干保護劑，以保持其理化性質穩定。 本研究發現，凍干保護劑除了改善PTX-HSG 凍干粉針的外觀性狀外， 還影響其粒徑大小。 未加入凍干保護劑的膠束凍干粉針呈“棉絮”狀，表面塌陷，而加入凍干保護劑后，膠束凍干粉針外觀得到明顯改善。 同時，凍干保護劑甘露醇和乳糖均在不同程度上增加了載藥膠束的粒徑，而葡萄糖則影響較小，推測可能是因為葡萄糖是單糖，結構為單一的六元環，沒有乳糖的二糖結構和甘露醇長鏈結構對膠束空間結構造成影響。 因此，選擇1%葡萄糖為PTX-HSG 最佳凍干保護劑。

溶血實驗納米膠束制劑作為注射劑臨床應用時，可能會導致紅細胞溶血現象的發生。因此，考察納米膠束的溶血性倍顯重要。 本實驗結果表明，在紫杉醇濃度0.01～0.2 mg／mL 濃度范圍內，PTXHSG 載藥膠束溶血百分數均＜2%，具有良好的血液相容性。