頸椎病實驗動物模型的研究進展

蔡明媚，陳 斌，傅玉雙，林安陽，修忠標，洪振豐，趙紅佳

（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004）

頸椎病又稱頸椎綜合征， 是頸椎骨關節(jié)炎、增生性頸椎炎、頸神經根綜合征、頸椎間盤脫出癥的總稱， 是一種以退行性病理改變?yōu)榛A的疾患［1］。長期的伏案工作、不良的坐姿或睡姿、不適當的體育鍛煉、頸椎的退行性變、長期勞損等都可以作為頸椎病的發(fā)病因素。 頸椎病可大致分為頸型頸椎病、神經根型頸椎病、脊髓型頸椎病、交感神經型頸椎病和椎動脈型頸椎病等［2］。 近年來社會經濟基礎的持續(xù)性發(fā)展、人類生活習慣的變化以及工作負擔的加重促使頸椎病的發(fā)生發(fā)展呈現年輕化的傾向，關于頸椎病的診治也在逐步引起重視。 許多專家學者為探討頸椎病的臨床治療療效，建立了大量的動物模型進行實驗研究，本文就近年來頸椎病相關實驗常用的動物模型綜述如下。

1 實驗動物的選擇

為了建造模型擬合度良好且可行性較高的頸椎病動物模型，以便于更準確、有效地研究頸椎病，選擇動物造模時常需符合以下條件： ①選用的造模動物其生理結構和功能應盡量接近人類； ②對動物進行造模后引起的頸椎病病變應盡可能滿足人體頸椎病發(fā)病的客觀規(guī)律；③造模方法經濟有效，操作過程簡單易行；④模型的重復使用率好，存活率高。按親緣關系來探討，猿、猴等高等動物與人類關系最近，其在結構及功能層面上也是最理想的造模動物，但是從飼養(yǎng)條件、倫理道德問題和相對較長的建模周期方面綜合考慮，一般較少用于實驗研究；豬、羊、犬等動物由于體型較大，有馴養(yǎng)場地、費用等限制，無法進行大樣本的實驗研究，在動物實驗中較少使用；兔、鼠之類的小型動物盡管不如大型動物的實驗操作準確、方便，但從實驗材料、成本、場所及訓養(yǎng)條件等角度綜合考慮，實驗可行性更高，且有利于長期觀察。 因此目前最常用的頸椎病造模動物是兔和鼠。

2 頸椎病分型造模方法

2.1 頸型頸椎病 頸型頸椎病是頸椎病發(fā)病初期的臨床類型，初起病情較輕，若遷延失治、誤治則容易進一步加重，轉變?yōu)榫哂衅髻|性改變的頸椎病。WANG 等［3］根據頸型頸椎病發(fā)病的致病因素，將家兔分為輕、中、重度刺激組置于風力6 級、溫度5 ℃左右、濕度100%的空間，模擬自然界風、寒、濕刺激以制備風寒濕痹型頸型頸椎病動物模型，每日持續(xù)4 h，分別歷時32、64、128 h。張欣等［4］結合屈頸過度及風、寒、濕致病因素建立無創(chuàng)兔頸型頸椎病模型，將大白兔固定于改良后的兔盒中迫使兔的頸部成45°低頭屈曲位，完全顯露兔頸部，剪除周圍毛發(fā)，將保濕冰袋敷于其上，使吹風機出風口對準兔頸部且保持風力5 級，持續(xù)2 h，每日重復2 次，共造模28 d。 張圓芳等［5］按照張欣等建模方法將造模時間改良為每日1 次，持續(xù)造模5 h，總共歷時56 d 以建造寒濕型兔頸型頸椎病動物模型，通過頸椎間盤組織形態(tài)學HE 染色觀察發(fā)現頸椎間盤髓核及纖維環(huán)發(fā)生改變且出現大量炎癥細胞。 唐學等［6］采用復合病因造模法即在張欣等造模基礎上改兔的頸部成低頭屈曲位60°，并延長造模時間為10 周，光鏡下觀察發(fā)現軟骨細胞變性消失、膠原纖維結構發(fā)生破壞。 劉福水等［7］亦采用此法迫使家兔保持低頭屈曲45°，每次5 h，每日1 次，持續(xù)12 周來建立頸型頸椎病模型進行實驗研究。 目前所采用的頸型頸椎病動物造模方法多以白兔長時間低頭屈曲為基礎進行改良，這類實驗模仿長期伏案工作、學習及長時間待在低溫空調房的人群， 通過檢測相關指標，證實坐臥姿勢不規(guī)范、生活習慣欠佳、機體持久勞損是頸型頸椎病發(fā)病的主要原因。

2.2 神經根型頸椎病 神經根型頸椎病的臨床發(fā)病率在50%～60%，是最常見的頸椎病類型，該病主要是由于骨質增生、頸椎間盤退行性改變造成頸神經根壓迫，引發(fā)頸、肩部麻木疼痛及功能障礙［8］。構建理想的動物模型是研究該類頸椎病的前提，對臨床治療此類頸椎病有著重大意義。

2.2.1 椎管插線法 SUN 等［9］采用椎管插線法對大鼠頸脊髓神經根造成持續(xù)性的擠壓以建立大鼠神經根型頸椎病模型，操作方法：大鼠麻醉、固定，剃凈頸部及背部周圍毛發(fā)，常規(guī)消毒，在頸部C4～T1區(qū)作一約3.5 cm 的中線切口，逐層分離皮下組織及頸后部肌群以充分顯露C4～C6椎板，刮凈表面附著物，切除C5～C6及C6～C7的黃韌帶，去除C6椎板的骨膜，在C6椎板下植入長15 mm、直徑0.5 mm的尼龍漁線，逐層閉合、縫合傷口，預防感染。 粟勝勇等［10］亦采用此法，在充分顯露C6～T2椎弓板并清除周圍組織的基礎上，暴露脊髓，執(zhí)顯微外科鑷將滅菌漁線沿脊髓縱向插入至C6、C7、T1神經根腋下。此造模方法造模后大鼠周圍神經異常癥狀出現較快，但因尼龍漁線壓迫力度較弱，導致癥狀持續(xù)性差，故此法較適用于急性期神經根型頸椎病的研究。

2.2.2 單純機械性壓迫 張忠亮等［11］采用將消毒滅菌的硅膠片直接壓迫頸神經根，成功建造神經根型頸椎病動物模型，操作方法：大鼠麻醉、固定，剃毛、消毒后沿C7棘突向上取頸部正中約4 cm 長切口，使C6椎板充分顯露，執(zhí)止血鉗咬除部分椎板及關節(jié)突，暴露神經根，將消毒滅菌的硅膠片輕置于C6神經根與硬膜囊交界處的下腋側， 縫合包扎傷口，造模完畢。 SMITH 等［12］亦根據單純性機械刺激頸神經根的造模方法， 通過剝離麻醉后大鼠C6、C7椎旁肌肉，咬除C6、C7部分椎板及關節(jié)突，充分顯露C7神經根，后用10 gf 微血管夾壓迫神經根15 min，術后采用測量大鼠同側前爪掌面對機械性刺激的痛覺敏感程度來評價該模型的可靠性。 LIU 等［13］則采用不銹鋼柱插入錐間孔中造成持續(xù)性壓迫來建立神經根型頸椎病模型，從而探討其疼痛機制。

2.2.3 機械性壓迫與炎癥刺激協(xié)同 金哲峰等［14］通過采用持續(xù)性機械性壓迫和炎性刺激大鼠，模擬慢性頸椎間盤及關節(jié)的雙重退變，以此建立神經根型頸椎病動物模型，并通過行為學、影像學、電生理學等證實該模型建造的實驗意義。 操作方法：大鼠麻醉、固定，剃除頸背部周圍毛發(fā)，常規(guī)消毒，于頸正中線取一4 cm 長切口，逐層切開皮膚、皮下組織及脊柱旁肌肉，使兩側關節(jié)突關節(jié)充分顯露，用34號鈍圓針頭接通輸液泵以4 μL／min 的速度依次注入膠原蛋白酶（每個關節(jié)注入5 μL）至C5／C6、C6／C7關節(jié)突關節(jié)，注入完畢，切除頸骼肋肌與半頭棘肌，再依次切斷頸背部深肌群頸夾肌及頭、頸、寰最長肌及C2～C7棘上和棘間韌帶，無菌閉合傷口，予青霉素抗感染。田園等［15］用浸有甲醛的定量濾紙片壓迫并刺激大鼠C7神經根，模仿炎癥性神經根型頸椎病的發(fā)病機制進行實驗模型建造。 此類模型運用了藥物介導與機械壓迫刺激手段進行建立，手術操作過程簡單、安全，且造模成功的實驗動物存活率較高。

2.3 脊髓型頸椎病 脊髓型頸椎病是由于頸椎結構的退行性改變導致椎管狹窄、脊髓慢性壓迫與功能障礙，進而引發(fā)相應的臨床癥狀，可使脊髓功能發(fā)生損傷，甚者導致肢體殘疾［16］。

2.3.1 螺釘壓迫法 螺釘壓迫法是于頸前路或頸后路置入螺釘，進行長時間壓迫動物頸脊髓以建立脊髓型頸椎病動物模型。 施立奇等［17］通過C2后路螺釘壓迫法建立脊髓損傷模型： 家兔常規(guī)消毒麻醉，取C2后側入路，于棘突正中執(zhí)咬骨鉗咬一“V”型骨缺損，先使用自攻螺釘于缺口處向椎板攻絲，然后改用平頭螺釘緩慢擰入造成壓迫。趙玲等［18］采用骨水泥壓迫釘置入頸前路C3椎體前方， 持續(xù)擠壓頸脊髓以模擬人脊髓型頸椎病發(fā)病機理。 此類造模方法操作過程相對簡單易行， 模型重復性良好，但是造模過程容易引發(fā)實驗動物死亡。

2.3.2 球囊壓迫法 此法是在實驗動物椎管內置入可控壓力的球囊，隨壓力的逐漸增大對脊髓產生進行性壓迫，進而模擬脊髓型頸椎病患者的發(fā)病過程。 沈寶良等［19］選用山羊為模型動物，使用球囊壓迫裝置經頸椎前路手術將其固定在C3椎體內，術后通過外置注射器向球囊內注入0.1 mL 碘海醇造影劑，1 周1 次，持續(xù)12 周，以此建立山羊脊髓型頸椎病模型。 此類造模方法多適用于犬、羊、豬等大型動物，死亡率較低。

2.3.3 植入法 楊宇等［20］采用大鼠自體骨植入法建造脊髓型頸椎病動物模型：暴露大鼠頸椎骨面，自C7基底部離斷棘突，取出并清除表面組織置于一旁備用；咬除C5或C6部分椎板，繼而取備好的、大小相應的骨塊植入椎間隙，向椎管內盡量嵌壓直到大鼠上肢出現反射性抽動，術畢肌注青霉素預防感 染。 YOSHIZUMI 等［21］在 其 慢 性 頸 脊 髓 壓 迫 模 型中通過在大鼠的C5～C6椎板下植入聚氨酯薄板，使其通過吸水逐漸膨脹以實現遲發(fā)性壓迫性脊髓型頸椎病的發(fā)生。 除上述植入物外，還有采用植入硅膠顆粒［22］、緩 慢 膨 脹 型 橡 膠［23］、聚 乙 烯 醇 丙 烯 酰 胺互穿網絡水凝膠［24］等進行脊髓型頸椎病的造模。

2.3.4 注射法 戎利民等［25］在X 線指引下經短毛豚鼠頸椎前路于C4～C5或C5～C6間隙距離椎體后緣5 mm 處插入4 號空針， 深度約2～3 mm， 注入0.1 mL 重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）／載體（PVP）復合物，對頸脊髓造成慢性持續(xù)性壓迫，術后8 周觀察發(fā)現短毛豚鼠頸脊髓受壓變形符合脊髓型頸椎病的椎體改變。楊家祥等［26］亦采用類似的造模方法，在大鼠頸椎間隙后緣注入重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白與載體的復合制劑， 持續(xù)性擠壓頸段脊髓，使椎間盤逐漸發(fā)生退變。

2.3.5 體外遙控壓迫裝置 李梓赫等［27］認為傳統(tǒng)的慢性脊髓壓迫模型存在手術創(chuàng)傷、感染風險大及可控性差等問題，為此，他們采用一種通過體外藍牙調控體內椎間壓力的裝置來建立慢性頸脊髓壓迫模型。 將成年小尾寒羊麻醉固定后，經其頸前路在X 線確認下切除C2／C3椎間盤直至椎體后緣，刮除椎體兩側終板， 該缺損與壓迫裝置大致等同，于椎間隙缺損處置入壓迫裝置，固定并將推桿頭部置于椎體后緣，之后將體內控制模塊埋入皮下，術后每2 天推進壓迫裝置一次，每次推進0.1 mm，定期觀察發(fā)現成年小尾寒羊的頸脊髓發(fā)生損壞。 體外遙控壓迫裝置是脊髓型頸椎病造模的一種新嘗試，具有可控性好、可重復性高的優(yōu)點，且建模過程只需手術操作1 次，造模費用低，可大范圍推廣應用。

2.4 椎動脈型頸椎病 椎動脈型頸椎病是由于頸椎發(fā)生退行性改變，導致椎動脈血流障礙，進而引起腦供血不足的一種頸椎病類型，臨床上約70%的頸椎病發(fā)病伴有椎動脈受累的表現［28］。因此對該類頸椎病的治療研究同樣至關緊要，而良好的實驗動物模型的建立必不可少。

2.4.1 注射組織硬化劑法 WANG 等［29］使用10 mL硬化劑消痔靈注射于家兔左側C3～C5頸椎橫突側面，第2 周和第4 周各重復1 次。 造模結束后用激光多普勒測量儀測定家兔頸椎動脈血流量，結果顯示造模家兔的椎動脈血流量明顯減少，說明該模型成立。 此項造模方法簡單、有效，是現今椎動脈型頸椎病應用相對廣泛的模型構建方法。

2.4.2 植骨壓迫法 宋敏等［30］將大鼠經腹腔麻醉后，于其頸背部取一正中縱形切口，充分開放右側頸部肌肉，暴露C5、C6椎體及橫突，切除橫突骨翼，緩慢分離椎動脈內側骨膜直到椎體后方，后將骨塊植入骨膜下間隙，逐層縫合，止血包扎。 最終通過檢測大鼠焦慮抑郁度、神經精神緊張度以及學習記憶能力等驗證植骨壓迫法建造椎動脈型頸椎病的模型具有統(tǒng)計學意義。

2.4.3 瘀血阻絡法 該法是直接取同種異體動物的血液制成瘀血直接注入模型動物的頸夾肌及頭夾肌內，使其瘀血阻絡，引發(fā)一系列椎動脈型頸椎病的癥狀表現。 LIU 等［31］在前人研究的基礎上使用直接誘發(fā)造模法復制椎動脈型頸椎病動物模型，取25%的生理鹽水與同種屬異體家兔的耳正中動脈血等比混合，往家兔一側頸夾肌、橫突間肌及橫突棘肌的肌內與肌間隙分別注入，共注射9 mL，在注射前及注射后2 周進行彩色超色檢測，發(fā)現該側椎動脈血流速度明顯減小，表明造模有效。

2.4.4 力學平衡失調 在模擬椎間盤病變造成的椎動脈型頸椎病時，SUN 等［32］根據動靜力平衡失調原理，將麻醉大鼠固定、消毒，于頸背部正中取一切口，依次切斷頸闊肌、頭頸寰最長肌、頸髂肋肌及頭半棘肌，并同時剪斷C2～C7椎體棘上韌帶和棘間韌帶，造成頸椎力學平衡失調。 逐層縫合傷口，3 個月后處死大鼠取其C4／C5、C5／C6椎間盤，經蘇木精和伊紅染色制成切片在光鏡下觀察發(fā)現造模后大鼠頸椎間盤形態(tài)發(fā)生改變，出現纖維環(huán)紊亂、髓核萎縮，說明此造模方法具有實驗意義。 YIN 等［33］亦采用此法來建立大鼠動靜力失衡的椎動脈型頸椎病模型， 其造模方法中除切斷上述肌群及韌帶外，還同時切斷頸斜方肌、菱形肌、淺層及深部肌肉，且分別切除1.5 cm 以防止愈合，數月后通過免疫組織化學觀察發(fā)現大鼠頸椎間盤出現退行性改變，說明模型成立。

2.4.5 椎動脈結扎法 此法是指通過對一側椎動脈進行離斷、夾閉或結扎使該側椎動脈供血不足，最終形成椎動脈型頸椎病。郭帥等［34］在家兔胸骨頸靜脈切跡上方作一橫型切口，尋找并分離右側臂叢神經，進而找到右側椎動脈第一段，將其分離，按照先近心端、后遠心端的順序進行縫線結扎，然后在結扎部位離斷椎動脈，縫合包扎。 通過免疫組織化學染色觀察及qRT-PCR 結果分析此種方法造模成功率達93%以上。

2.4.6 混合法 混合法即是上述2 種或多種造模方法結合形成，目前應用造模效果良好。 如李清林等［35］在其實驗研究中將一側力學平衡失調法與對側骨膜下植骨壓迫法相結合，通過切除大鼠左側頸闊肌、頸斜方肌、頸部夾肌、頭頸菱形肌、最長肌、頸髂肋肌、半棘肌，以及切斷頸闊肌、頭頸寰最長肌等造成大鼠左側肌力失衡， 同時分離對側C5、C6椎體前頸長肌，將骨塊植入已經分離的椎動脈骨膜下間隙，造成持續(xù)壓迫，造模結束后通過曠場實驗觀察造模后大鼠站立次數、運動距離、修飾次數等均顯著減少，表明造模成功。 賈力莉等［36］在研究芪葛止眩顆粒對椎動脈型頸椎病的療效時，采用動力平衡失調法合并注射硬化劑法來復制模型，在常規(guī)切除頸部部分肌肉組織造成左側頸部動力失衡的基礎上，于術后第2 周、第4 周在左橫突側面分別注入消痔靈注射液2 mL、1 mL，通過拍攝頸椎X 線片及檢測椎基底動脈血流、血液流變學驗證椎動脈型頸椎病模型是否成模。 現如今對椎動脈型頸椎病的研究與時俱進，造模方法也日益成熟，混合造模法的模型復制成功率也逐漸升高。

3 總 結

現今面臨著時代進步帶來的壓力和挑戰(zhàn)，人類罹患頸椎病的年齡逐漸趨向年輕化，對于頸椎病治療的研究顯得越發(fā)重要。 出于倫理道德方面的考慮， 實驗通常建立動物模型來模擬人頸椎病的發(fā)生、發(fā)展，探討該病的預防與治療。 當前采用實驗性誘發(fā)、復制頸椎病動物模型的方法多種多樣，已經能基本模擬各種類型頸椎病的病因及發(fā)病機制，滿足實驗要求，但總結當前已經報道的各種頸椎病動物模型，仍可發(fā)現尚具有以下不足：①造模方法單一，缺乏綜合模擬模型：目前實驗中的造模方式多以單一動物或單一操作方法為主，雖然造模過程較為簡單易行，但尚不能實現頸椎病發(fā)展過程中呈現的復雜性、全面性及不可控性；②造模時間較長：總結發(fā)現近年報道的頸椎病動物造模時間多為每天4～6 h，持續(xù)2～3 月，造模周期仍較長；③動物存活率偏低：手術創(chuàng)傷、術后感染、造模動物焦躁不安等因素仍持續(xù)影響造模動物的存活率；④缺乏頸椎病中醫(yī)證候動物模型的制備：現階段中醫(yī)對頸椎病的治療療效顯著，中醫(yī)治療得到患者的滿意與推崇，但實驗對研究中醫(yī)證候分型方面的頸椎病模型制備方法仍較缺乏，不能為中醫(yī)藥治療頸椎病提供充分有效的科學研究依據。 因此，對頸椎病動物模型的創(chuàng)立可向更深、更全面的層次發(fā)展，從頸椎病多種復雜病因、發(fā)病機制、生理病理結構擴展到研究分子生物學、力學及中醫(yī)證候表現等方面，建立公認的可行性佳、重復率高、綜合模擬性高的頸椎病動物模型，充分研究和發(fā)揮中醫(yī)藥與現代醫(yī)學相結合的優(yōu)勢與展望。