不同比例甘草炮制對吳茱萸水提物指紋圖譜和肝毒性的影響

趙芳菲，程再興，蔡真真，王冰萍，王 瀟，陳 紅*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122；2.海滄區嵩嶼街道社區衛生服務中心，福建 廈門361026）

用甘草炮制藥材的記載，始于南北朝，沿用至今，并載入《中國藥典》。 曾被記載采用甘草炮制的中藥材有70 多種，但目前在《中國藥典》和“地方中藥材飲片炮制規范” 中收載的品種不超過7 種，常用的有制巴戟天、制吳茱萸、制遠志、制附子、法半夏、制地龍等［1］，其中制巴戟天、制吳茱萸和制遠志均采用與甘草比為100∶6 的比例。 甘草汁作為輔料炮制中藥可降低或消除藥物毒副作用和提高藥效，但對化學成分類別明顯不同的三種藥材均采用100∶6 比例甘草炮制仍缺少科學的解釋。 關于吳茱萸采用甘草炮制的方法、炮制前后化學成分及藥理毒性變化的研究已有很多［2-6］，但未見不同比例甘草炮制對吳茱萸化學成分和毒性影響的報道。 本文采用不同比例的甘草炮制吳茱萸，從炮制前后HPLC指紋圖譜和致小鼠肝毒性作用的變化入手，初步探討不同比例甘草炮制對吳茱萸水提物中化學成分及致肝毒性作用的影響，為深入探討制吳茱萸的炮制原理及繼承和發揚“甘草汁”制法奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF 級ICR 小鼠， 體質量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證號：SCXK（滬）2017-0026，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，所有動物實驗均按照福建中醫藥大學動物實驗指導原則進行。

1.2 試藥 乙腈（美國默克公司）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；丙氨酸轉氨酶（ALT）試劑盒（批號：20170315）、草胺酸轉氨酶（AST）試劑盒（批號：20170315）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：2017 0320）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒（批號：20170323）、一氧化氮合酶（NOS）試劑盒（批號：20170316）、考馬斯亮藍試劑盒（批號：20170421），均購自南京建成生物工程研究所。 吳茱萸（安徽省本草國藥飲片有限公司，批號：20140916）和甘草（福州回春中藥飲片廠有限公司，批號：12030506）飲片經由福建中醫藥大學鑒定教研室楊成梓教授鑒定，均符合《中國藥典》2015 版要求。

1.3 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，大連依利特科學儀器有限公司）；BSA323S 型精密電子天平［Max320 g，d＝1 mg，賽利多斯科學儀器（北京）有限公司］；DZF-6021 真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；UV-9600 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 甘草汁制備 取一定量甘草，加10 倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，過濾。第二次加5 倍量的水，煎煮30 min，過濾，合并2 次濾液，濃縮，保存備用。 根據藥材量及所用甘草比例稀釋上述濃縮液，得不同濃度的甘草汁。

2.1.2 吳茱萸炮制 取甘草汁浸泡吳茱萸，攪拌均勻后悶潤15 h，放置炒鍋清炒待汁吸盡（約10 min），起鍋，置烘箱烘干備用。 不同比例的甘草制品均按上述方法用不同濃度的甘草汁進行炮制。

2.1.3 水提物制備 取吳茱萸生品或制品，加10倍量水浸泡30 min 后，煎煮30 min，過濾。 第二次8倍量水煎煮30 min，過濾，合并2 次濾液，濃縮至一定體積，配制得吳茱萸生品及制品的水提物（含生藥1 g／mL），置于-20 ℃冰箱中保存備用。

2.2 HPLC 指紋圖譜色譜條件 色譜系統：LC-20AT 島津高效液相色譜儀；色譜柱：C18柱：（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；進樣體積：20 μL；流速：1.0 mL／min；流動相梯度：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），0～3 min，B：95%～95%，3～7 min，B：95%～92%，7～18 min，B：92%～92%，18～35 min，B：92%～75%，35～40 min，B：75%～75%，40～50 min，B：75%～50%，50 ～55 min，B：50%～50%，55 ～60 min，B：50%～35%，60～70 min，B：35%～35%； 檢測波長：327 nm［7-8］。

2.3 肝毒性實驗

2.3.1 分組與給藥 60 只小鼠（雌雄各半）適應性飼養3 d， 禁食不禁水12 h 后按體質量隨機分為6組，依次為空白組、生品組、100∶3 制品組、100∶6 制品組、100∶12 制品組、100∶24 制品組，分別給予生理鹽水、吳茱萸生品水提物和相應比例的吳茱萸制品水提物灌胃，劑量為30 g／（kg·d）（以生藥量計），每天灌胃1 次，連續干預21 d，第22 天于禁食不禁水12 h 后取血及肝臟樣本。 給藥期間每3 天稱1次體質量，并根據體質量調整給藥劑量，同時觀察小鼠的飲食、飲水、毛色等一般狀況并記錄。

2.3.2 血清樣品制備 摘眼球取血，8 000 r／min，離心10 min，轉移血清，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

2.3.3 肝組織樣品制備 取小鼠肝臟，稱重，計算肝體指數。取肝組織用1∶9 的生理鹽水勻漿后，8 000 r／min 離心10 min，分離上清液，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

肝體指數＝肝臟質量／體質量×100%

2.3.4 指標檢測 采用紫外分光光度計，并按照試劑 盒 說 明 書 檢 測ALT、AST、T-SOD、NOS、MDA 等指標。

2.4 統計學方法 采用SSPS 20.0 軟件進行數據統計，計量資料符合正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗。

3 結 果

3.1 吳茱萸生品和制品水提物指紋圖譜比較 通過比較吳茱萸生品和制品水提物HPLC 指紋圖譜發現了14 個共有峰作為特征性色譜峰（見圖1）。從表1 對14 個特征性色譜峰峰面積比較可以看出：吳茱萸采用100∶6 的甘草炮制與100∶3 和100∶24比例的甘草炮制對部分成分（如峰2～3 和5～8）含量的影響呈現相反的趨勢，而100∶12 制品則未改變該部分成分的相對含量；在100∶6 制品與100∶3 和100∶24 制品間14 個峰的峰面積均有明顯差異（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001），與100∶12 制品間7 個峰的峰面積有明顯差異（P＜0.05 或P＜0.01），即不同比例的甘草炮制對吳茱萸水提物中化學成分的含量產生明顯影響。

圖1 吳茱萸生品和制品水提物HPLC 指紋圖譜比較

3.2 6 組小鼠肝體脂數及血清中AST 和ALT 活力比較 實驗中小鼠在給藥期間，空白組活動行為正常，毛色發亮，進食飲水均正常，體重增加，生品組小鼠在給藥期間出現活動減少，行為倦怠，毛色無光，稀松，便秘等現象，而制品組小鼠上述癥狀出現的情況相比生品組較輕微，各組間動物飲食飲水量都較正常，但各組間動物體質量變化沒有表現出明顯的差異。 從肝體指數、AST 和ALT 變化的比較可以看出吳茱萸生品和制品均具有肝毒性，但甘草炮制可使吳茱萸致肝毒性作用明顯減弱，尤以采用100∶6 和100∶12 比例甘草炮制作用最好， 結果 見表2。

表1 吳茱萸生品和制品水提物HPLC 指紋圖譜中特征峰峰面積比較（n＝3，x±s） ×10 000 UA

表2 6 組小鼠肝體指數及血清中AST 和ALT 活力比較（x±s）

3.3 6 組小鼠肝勻漿中T-SOD 和NOS 活力及MDA含量比較 吳茱萸生品可降低小鼠肝臟T-SOD 活力（P＜0.05），而甘草炮制可逆轉這一作用，使小鼠肝臟T-SOD 活力提高（P＜0.05 或P＜0.01），同時也提高了NOS 活力（P＜0.05 或P＜0.01）。 表明甘草炮制可減輕吳茱萸導致的小鼠肝臟抗氧化能力損傷，結果見表3。

表3 6 組小鼠肝勻漿中T-SOD 和NOS 活力及MDA 含量比較（x±s）U／mgprot

4 討 論

指紋圖譜是控制藥材質量和區分不同產地藥材的較好方法，廣泛為中藥研究者所應用。 甄攀等［7］建立吳茱萸水溶性成分指紋圖譜，并對不同批次、不同產地和不同季節的吳茱萸進行比較分析。同樣也可用指紋圖譜分析藥材炮制前后化學成分的變化情況，如溫慧玲等［8］通過比較吳茱萸生品和有／無甘草制品間指紋圖譜的變化發現生品與制品的成分存在顯著性差異，且有甘草炮制可降低吳茱萸中部分成分的量。 而張曉鳳等［9］的研究則發現加熱是影響吳茱萸主要成分溶出的炮制因素，甘草汁的加入對吳茱萸內酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的影響不大。 在本次研究中發現采用100∶6 比例的甘草炮制可降低吳茱萸水提物中部分化學成分（如峰2，3，5，6，7 等）的相對含量，而100∶3 和100∶24 比例甘草炮制卻反而使其增加，100∶12 比例的甘草炮制未對其產生影響。在100∶6 制品中14 種成分的含量均明顯低于100∶3 制品和100∶24 制品，也有7 種成分的含量低于100∶12 制品，表明甘草炮制對吳茱萸的化學成分有較大影響，且不同比例的甘草炮制影響趨勢完全不同。 其中100∶6 的甘草炮制可降低吳茱萸水提物中部分成分的含量與溫慧玲等［8］的研究結果相一致，這可能是吳茱萸采用100∶6 比例甘草炮制的目的之一。

明代《景岳全書》記載：“元氣虛者，當以甘補藥制而用之”， 吳茱萸的甘草炮制法是在此理論的啟發下而在近代發展起來的。 甘草有較強的解毒作用，且甘緩益氣，可抑制吳茱萸過于辛熱走散，耗氣傷陰之弊，因此有“甘補藥制為現代甘草制吳茱萸之濫觴”之說。 現代研究認為吳茱萸有較強的肝毒性，并發現吳茱萸水提物和醇提物及其揮發油類成分均有肝毒性，肝毒性產生的主要機制是增加肝臟的脂質過氧化反應，而炮制（不僅是甘草汁，也包括其他炮制方法）可減輕吳茱萸的肝毒性［5-6，10-11］。 在本次試驗中以肝體指數、AST 和ALT 的變化來分析不同比例甘草炮制對吳茱萸肝毒性的影響，結果表明吳茱萸不同比例制品與生品一樣均可引起肝體脂數、AST 和ALT 增加， 說明生品和制品均具有肝毒性， 而各比例的甘草制品組AST 和ALT 均低于生品組則說明甘草炮制有減弱吳茱萸致小鼠肝毒性的作用，尤其100∶6 和100∶12 比例甘草炮制作用最為明顯。 從吳茱萸生品組T-SOD 活力降低說明吳茱萸導致肝毒性的產生與其降低肝臟的抗氧化能力密切相關，而制品組T-SOD 和NOS 活力均強于空白組和／或生品組則說明采用甘草炮制可逆轉吳茱萸導致小鼠肝臟抗氧化能力減弱的作用。 這提示防止過度減弱肝臟抗氧化酶的活力而減輕肝毒性可能是吳茱萸采用甘草炮制的另一目的。

總之， 研究發現采用100∶6 比例的甘草炮制導致水提物中部分成分含量降低，這可能是甘草炮制降低吳茱萸肝毒性的原因之一。 但本次研究只是對吳茱萸采用不同比例的甘草炮制進行初步的探討，無論是指紋圖譜還是肝毒性的研究都不夠深入，而且僅僅從降低肝毒性角度考察吳茱萸炮制所用甘草的比例也不夠準確，還需要結合不同比例甘草炮制對吳茱萸功效和其他毒副作用影響研究，才能全面評價和闡述吳茱萸采用甘草炮制的目的和原理。