巴戟天不同炮制品對大鼠肝藥酶CYP3A 的影響

陳 紅，蔡真真，林麗虹，張清華，程再興

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

細(xì)胞色素P450 酶素（CYP）中的CYP3A 參與臨床約50%藥物的代謝，是最重要的P450 酶之一，同時CYP3A 被誘導(dǎo)或抑制是藥物產(chǎn)生代謝性相互作用的主要原因。 研究藥物對CYP3A 的影響，可以預(yù)測藥物間的相互作用，從而提高療效，減少不良反應(yīng)［1-2］。 巴 戟 天 為 茜 草 科 植 物 巴 戟 天（Morinda Officinalis How）的干燥根，有補肝腎、強筋骨、祛風(fēng)濕的作用，為“四大南藥”之一，臨床中除用生巴戟天飲片外，還有鹽巴戟天和制巴戟天飲片，其不同飲片的功效和臨床應(yīng)用各有側(cè)重。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天不僅具有與功效相關(guān)的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕等藥理作用外，還有抗腫瘤、抗抑郁等作用［3-5］，而巴戟天對肝藥酶的影響研究較少，本文通過采用肝微粒體體外溫孵法、定量PCR 和Western blot 技術(shù)，觀察巴戟天不同炮制品對CYP3A 活性、蛋白及mRNA 表達(dá)的影響，為巴戟天臨床配伍用藥和深入研究其炮制機理提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實驗藥材 巴戟天產(chǎn)自福建永定，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級實驗師鑒定為茜草科植物巴戟天（Morinda Officinalis How）的干燥根，符合2015 版《中國藥典》的要求。

1.3 試劑與儀器 苯甲基磺酰氟化物、二硫蘇糖醇（美國Sigma-Aldrich 公司）；Agilent 1290 超高效液相色譜儀（UPLC，美國Agilent 公司）；Elix 超純水系統(tǒng) （美國Milipore 公司）；solutionA、B （還原型輔酶A、B 溶液，美國BD biosciences 公司）；睪酮、6β-羥基睪酮（日本nacalaitesque 公司，純度＞98%）；吉非貝齊（內(nèi)標(biāo)，美國Sigma-Aldrich 公司，純度＞98%）；乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；大鼠CYP3A 抗體一抗（兔抗鼠抗體，美國Abcam 公司）；二抗（羊抗兔抗體，美國Santa Cruz 公司）；BT25S型精密電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；CS150NX型超高速離心機（日本Hitachi 公司）；pH計（瑞士Mettler Toledo 公司）；酶標(biāo)儀、垂直電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）；MS3digital 型渦旋 振 蕩 器（德 國IKA 公司）；5810R 型高速離心機（德國Eppendorf公司）；ABI 7500 PCR 擴增儀（美國Applied biosystems 公司）。

2 實驗方法

2.1 供試液的制備 分別稱取巴戟天不同飲片，用10 倍量水浸泡30 min 后，煎煮30 min，過濾后再加5 倍量水煎煮30 min，合并煎煮液，減壓濃縮，1 000 r／min 離心5 min，去沉淀，得濃度為0.2 g／mL（生藥重／藥液體積，下同）藥液，取部分稀釋成0.1 g／mL 和0.5 g／mL 濃度的藥液，低溫保存?zhèn)溆茫?］。

2.2 動物分組及給藥 將110 只大鼠隨機分為空白對照組、苯巴比妥0.1 g／kg 劑量組和生／制／鹽巴戟天2.0、1.0、0.5 g／kg 劑量組，連續(xù)予相應(yīng)劑量的藥液灌胃給藥7 d（空白對照組給予等量蒸餾水）。

2.3 肝微粒體制備 大鼠連續(xù)給藥7 d 后，用烏拉坦（50% w／v，每只約0.6 mL）腹腔注射麻醉，用冰冷的肝臟沖洗液從肝門靜脈在體沖洗肝臟至土黃色，剪取同部位肝臟組織（5.0±0.5） g 置于沖洗液中，在4 ℃冷庫將其切碎，用冰冷的勻漿緩沖液勻漿。 勻漿液10 400 r／min 離心15 min；取上層溶液35 000 r／min 離心1 h，得肝微粒體。 所得肝微粒體均勻混懸于250 mmol／mL 蔗糖中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫?］。 肝微粒體總蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定。

2.4 Ⅰ相代謝反應(yīng)體系及分析 在450 μL KPI 溶液中分別加入25 μL Solution A、5 μL Solution B 和10 μL 肝微粒體懸液，37 ℃、150 r／min 下水浴搖床預(yù)孵育5 min，再加入10 μL 睪酮（4、10、30 μmol／L）繼續(xù)孵育7／15 min，取出后立即冰浴并加入4 mL 冰冷二氯甲烷終止反應(yīng)， 加入10 μL 的2 mmol／L 吉非貝齊作為內(nèi)標(biāo)，3 000 r／min 渦旋8 min 后，1 000 r／min 離心15 min，取下層液3.5 mL，置于真空干燥箱中干燥后-20 ℃保存。 分析時加入100 μL 乙腈渦旋3 min，再加入100 μL 超純水渦旋3 min，13 000 r／min 離心30 min，取上清液10 μL，UPLC 進(jìn)樣分析，代謝速率以6β-羥基睪酮的生成量進(jìn)行計算［8］。

2.5 色譜條件 色譜系統(tǒng)：Agilent 1290 Infinity UPLC System，Agilent RRHDSB-C18 色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 m），流動相A 乙腈，流動相B 水（0～2.5 min，70%～10% B；2.5～4 min，10%～50% B；4～5 min，50%～70% B；5～6 min，70% B），流速0.4 mL／min，柱溫40 ℃，檢測波長235 nm，洗脫時間6 min，進(jìn)樣體積10 μL。

2.6 Western blot 實驗 取10 μg 肝微粒體蛋白，用10% SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)印到PVDF 膜，再用含有5%脫脂牛奶的TBST 封閉2 h。 漂洗后將膜與CYP3A 一抗（1∶3 000）置于4 ℃孵育過夜，用TBST清洗膜3 次，每次5 min，加入二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h。 采用ECL 試劑使膜發(fā)光，并通過Quantity One（Bio-Rad）對蛋白條帶進(jìn)行熒光定量，結(jié)果采用灰度值進(jìn)行分析。

2.7 PCR 實驗 肝臟組織中總RNA 采用TRIzol提取法進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，于PCR 擴增儀進(jìn)行擴增和檢測。 擴增中所需CYP3A引物按照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行設(shè)計，CYP3A1：forward primer 5′-GGAAATTCGATGTGGAGTGC-3′，reverse primer 3′-AGGTTTGCCTTTCTCTTGCC-5′；CYP3A2：forward primer 5′-AGTAGTGACGATTCCAACATAT-3′，reverse primer 3′-TCAGAGGTATCTGTGTTTCCT-5′；GAPDH：forward primer 5′-CTGTGGTCATGAGCCCC TCC-3′，reverse primer 3′-CGCTGGTGCTGAGTATG TCG-5′。 結(jié)果采用2-ΔΔCT值進(jìn)行分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 巴戟天不同炮制品對CYP3A 酶活性的影響見表1。

表1 巴戟天不同炮制品對大鼠肝微粒體Ⅰ相代謝體系中6β-羥基睪酮生成速率影響的比較（±s，n＝3）nmol／（mg·min）

表1 巴戟天不同炮制品對大鼠肝微粒體Ⅰ相代謝體系中6β-羥基睪酮生成速率影響的比較（±s，n＝3）nmol／（mg·min）

注：與空白對照組比較，1） P＜0.05；與相應(yīng)劑量及底物濃度的生巴戟天組比較，2） P＜0.05。

組別空白對照組苯巴比妥組生巴戟天組制巴戟天組鹽巴戟天組劑量／（g／kg）—0.1 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 4 μmol／L 1.52±0.02 2.49±0.451）2.32±0.311）2.46±0.581）1.70±0.11 2.57±0.091）2.67±0.311）3.40±0.201）2）2.48±0.141）3.31±0.231）2）2.59±0.171）2）睪酮濃度10 μmol／L 2.23±0.13 3.68±0.101）3.29±0.221）3.28±0.181）2.38±0.16 3.58±0.121）3.75±0.441）2）5.01±0.391）2）3.62±0.081）5.02±0.221）2）3.96±0.161）2）30 μmol／L 3.07±0.12 5.38±0.161）4.54±0.171）4.74±0.551）3.37±0.16 4.95±0.371）4.62±0.831）7.26±0.281）2）4.48±0.181）6.59±0.371）2）5.40±0.501）2）

3.2 巴戟天不同炮制品對CYP3A 酶蛋白和mRNA表達(dá)的影響 見表2。

4 討 論

P450 酶的被誘導(dǎo)或抑制與藥物間產(chǎn)生的代謝性相互作用密切相關(guān)，當(dāng)P450 酶被抑制時會導(dǎo)致共服藥物代謝減慢，血藥濃度出現(xiàn)不可預(yù)期的升高，引發(fā)副作用甚至引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，當(dāng)被誘導(dǎo)時又可導(dǎo)致共服藥物代謝加快而使藥效降低。 P450 蛋白和mRNA 表達(dá)水平的變化是引起酶活性變化的主要機制。 在大鼠肝臟中CYP3A 主要包括CYP3A1、CYP3A2 和CYP3A23 等 亞 型，其 中CYP3A1 和CYP3A2是最主要的亞型，參與多數(shù)臨床用藥的代謝過程［1-2，10］。

表2 巴戟天不同炮制品對大鼠肝微粒體CYP3A 蛋白和肝組織CYP3A mRNA 表達(dá)水平影響的比較（±s，n＝3）

表2 巴戟天不同炮制品對大鼠肝微粒體CYP3A 蛋白和肝組織CYP3A mRNA 表達(dá)水平影響的比較（±s，n＝3）

注：與空白對照組比較，1） P＜0.05；與相應(yīng)劑量及底物濃度的生巴戟天組比較，2） P＜0.05。

組別空白對照組苯巴比妥組生巴戟天組制巴戟天組鹽巴戟天組劑量／（g／kg）—0.1 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0蛋白表達(dá)水平1.00±0.00 3.44±0.121）3.15±0.081）3.57±0.581）2.30±0.041）2.19±0.351）1.94±0.172）2.66±0.171）2.30±0.361）2.57±0.881）4.03±1.591）2）mRNA 表達(dá)水平CYP3A1 1.00±0.00 3.82±0.211）3.14±0.081）3.57±0.561）2.31±0.041）2.30±0.361）2.57±0.881）4.03±1.591）2）2.19±0.351）1.94±0.172）2.66±0.211）CYP3A2 1.00±0.00 2.98±0.091）2.20±0.021）1.69±0.01 1.96±0.011）2.11±0.081）2.11±0.031）2）2.11±0.021）2.14±0.081）3.29±1.141）2.15±0.931）

中藥在采用藥汁或輔料炮制后可能會產(chǎn)生對P450 增強或減弱的作用，從而改變組方用藥后的效果，同時也可能會導(dǎo)致自身某些成分代謝的加快或減慢而改變藥理作用。 巴戟天主要含有水晶蘭苷等環(huán)烯醚萜類、甲基異茜草素等蒽醌類和巴戟天多糖及揮發(fā)油等，通過鹽和甘草汁制后環(huán)烯醚萜類和蒽醌類等成分都會發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致生、鹽、制巴戟天功效發(fā)生變化［11-15］。

本文研究結(jié)果表明，生巴戟天在《中國藥典》規(guī)定的3～10 g（人用量，下同）劑量范圍內(nèi)對大鼠肝藥酶CYP3A 活性有誘導(dǎo)作用，當(dāng)達(dá)到20 g 的劑量時對CYP3A 不具有誘導(dǎo)作用，而制巴戟天和鹽巴戟天在5 g、10 g 和20 g 的劑量下對CYP3A 均有誘導(dǎo)作用，其中制巴戟天隨著劑量的增加誘導(dǎo)作用增強，而鹽巴戟天在10 g 劑量下的誘導(dǎo)作用最強。 生巴戟天經(jīng)過甘草汁制后， 在5 g 和10 g 劑量下對CYP3A的誘導(dǎo)作用未發(fā)生明顯變化，在20 g 的劑量下誘導(dǎo)作用明顯增強；經(jīng)用鹽炮制后，在5 g 劑量下誘導(dǎo)作用也未發(fā)生明顯變化，在10 g 和20 g 的劑量下誘導(dǎo)作用明顯增強。 巴戟天各種炮制品均可誘導(dǎo)CYP3A 蛋白和CYP3A1、CYP3A2 mRNA 的表達(dá)增加。

以上結(jié)果說明巴戟天在炮制前后對CYP3A 均有一定的誘導(dǎo)作用，用甘草汁和鹽炮制后誘導(dǎo)作用進(jìn)一步增強，尤其是甘草汁制巴戟天隨著用藥量的增加，誘導(dǎo)作用也隨之增強，主要機理可能與其可誘導(dǎo)CYP3A 蛋白及CYP3A1、CYP3A2 mRNA 的表達(dá)增加有關(guān)。 炮制后誘導(dǎo)作用的增強將會進(jìn)一步加速某些成分在體內(nèi)的代謝，巴戟天炮制后抗炎鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)濕作用減弱，而補腎助陽作用突顯，這可能與相關(guān)成分的代謝增加有一定的關(guān)系。 由于中藥成分體系的復(fù)雜性，還需要進(jìn)一步明確巴戟天不同功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)及其體內(nèi)過程等相關(guān)內(nèi)容，才能更進(jìn)一步地揭示巴戟天采用鹽和甘草汁炮制的機理。