基于ANXA1／VEGF 通路研究片仔癀對肝癌腹水小鼠的保護作用

林 雅，賴文芳，李聰翀，劉毓東，林國清

（1. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122；2. 福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州350004）

肝癌是臨床常見惡性腫瘤之一，近年來發病率及病死率逐步升高，全球發病的地區中以亞洲和南非為本病的高發區，尤其是在我國，每年新發肝細胞癌病例占全球50%以上，其病死率位居第3位，在某些農村高發地區甚至為第1 位［1-2］。 福建名方片仔癀自明代起作為清熱解毒、消瘀散結的復方被廣泛應用至今，研究發現其對肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者在保肝退黃、控制腫瘤發展、提高生活質量、緩解疼痛等方面有確切療效，同時可改善由化療藥物引起的肝功能異常［3-6］。 本課題以膜聯蛋白A-1（annexin-A1，ANXA1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內皮細胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）作為切入點，通過觀察片仔癀對H22 肝癌腹水小鼠的影響，探討片仔癀抑制保護肝功能的作用機制，為其臨床應用提供深入的理論基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與細胞 SPF 級ICR 小鼠，雄性，體質量20～24 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2014-0002，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 條件的層流柜下。人肝癌細胞H22 購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 藥物與試劑 片仔癀（漳州片仔癀藥業股份有限公司生產，批號：0908035）；環磷酰胺（美國Sigma公 司，批 號：WXBC4024V）；ALT、AST 試 劑 盒（貝爾曼庫爾特實驗系統有限公司，貨號：Z409226、Z507224）；ANXA1 抗體（英 國Abcam 公司，貨號：ab97485）；VEGF 抗體、VEGFR 抗體、NF-κB p50 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，貨號：#2463、#9698、#3035）；超敏ECL 化學發光試劑盒（碧云天生物技術有限公司，貨號：P0018）。

1.3 實驗儀器 Infinite M200 Pro 多功能酶標儀（美國TECAN 公司）；Mini PROTEAN Tetra 小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot 小型轉印槽、ChemiDoc XRS＋凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 實驗方法

2.1 模型制備 依據文獻及本課題組前期造模方法［7-8］，將H22 肝癌細胞制備為1×107個／mL 的 活細胞懸液，按0.2 mL／只腹腔注射在瘤源鼠腹腔內。接種7 d 后將瘤源鼠脫頸處死，抽取出癌性腹水，制成1×107個／mL 的活細胞懸液，按0.2 mL／只腹腔注射，建立肝癌腹水模型。

2.2 分組與給藥 將40 只雄性ICR 小鼠，適應性飼養1 周后，隨機分為正常組（n＝10）和造模組（n＝30），造模組建立肝癌腹水模型后再隨機分為模型組、片仔癀組和環磷酰胺組。 片仔癀組按0.2 g／（kg·d）予片仔癀藥液灌胃，環磷酰胺組按0.07 g／（kg·d）予環磷酰胺灌胃，正常組和模型組均予等容積蒸餾水灌胃。 造模24 h 后第1 次給藥，每日灌胃給藥1次，連續給藥7 d。

2.3 檢測指標

2.3.1 藥效學指標檢 實驗過程中每日測量體質量（g），給藥7 d 后脫頸椎處死小鼠，測量體質量（g）及腹圍（cm）后，抽取腹水測量腹水量（mL）。

2.3.2 血清ALT、AST 含量檢測 小鼠末次給藥后24 h，摘眼眶取血，3 000 r／min 離心15 min，分離血清，使用酶速率法按檢測試劑盒操作方法和步驟檢測血清ALT、AST 含量。

2.3.3 肝組織病理學檢測 小鼠脫頸椎處死，迅速剖腹摘取同樣部位的部分肝臟，將一部分肝臟置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h 后， 按常規脫水包埋、切片后進行蘇木素-伊紅染色（HE 染色）。

2.3.4 Western blot 法檢測 提取細胞總蛋白，配膠電泳。 轉膜成功后TBS 洗1 遍，將PVDF 膜浸泡在封閉液中，置于搖床上室溫封閉2 h。TBS 洗滌10 min，加入ANXA1 一抗（1∶800）、VEGF 一抗（1∶800）、VEGFR 一抗（1∶800）、NF-κB p50 一抗（1∶600）、PCNA（1∶3 000）、β-actin（1∶3 000），4 ℃孵育過夜。 TBS洗滌后加入二抗，搖床室溫孵育2 h。 TBS 洗滌（10 min×3），顯影。

2.4 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學處理。 計量資料符合正態分布以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊用LSD 方法，方差不齊采用Games-Howell 方法；不符合正態分布的數據采用非參數檢驗。

3 結 果

3.1 小鼠一般情況 接種H22 肝癌細胞懸液造模后，模型小鼠體質量從第4 天開始明顯高于正常小鼠，模型組、環磷酰胺組各死亡1 只，片仔癀組死亡2 只，總成模率約85%。

3.2 4 組小鼠體質量、腹水、腹圍指標比較 見表1。注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05。

表1 4 組小鼠體質量、腹水、腹圍指標比較（±s）

腹圍／cm 7.80±0.37 9.44±0.491）8.71±0.842）8.49±0.922）組別正 常 組模 型 組片仔癀組環磷酰胺組n 10 989體質量／g 32.28±0.77 38.57±3.021）36.60±3.332）34.04±1.862）腹水／mL—8.37±0.76 7.59±0.622）7.04±1.202）

3.3 4 組小鼠血清ALT、AST 含量比較 見表2。

表2 4 組小鼠血清ALT、AST 含量比較（x±s）IU／L

3.4 4 組小鼠肝組織HE 染色結果 正常小鼠肝臟被膜無炎性細胞侵潤，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀，肝小葉結構完整，肝細胞未見明顯脂肪變性、壞死；模型組小鼠肝臟肝索排列紊亂，肝小葉結構不清晰，肝細胞出現大小不等的脂肪空泡，脂肪性變明顯，部分肝細胞胞漿出現液化、退變甚至被吸收消失；片仔癀組肝索排列紊亂程度較模型組有所改善，肝小葉結構較為清晰，脂肪空泡減少，肝細胞的液化、退變現象明顯比模型組減少；環磷酰胺組與模型組肝臟組織病理形態學并無出現任何加重或者減輕的趨勢。 見圖1。

圖1 4 組小鼠肝組織HE 染色圖（×200）

3.5 4 組小鼠肝組織ANXA1、VEGF、VEGFR 及NFκB p50 蛋白表達比較 見圖2。

4 討 論

肝癌信號轉導通路是近年來研究熱點，主要集中在肝癌細胞凋亡增殖、腫瘤血管增生等各個層次。ANXA1 是膜聯蛋白超家族中第一個被發現的成員，近年研究表明ANXA1 參與炎癥過程，可以抑制炎癥介質的合成及釋放，抑制磷脂酶A2 的表達，從而抑制中性粒細胞合成釋放炎癥介質［9-11］，而ANXA1 的抗炎作用可能與NF-κB、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Akt）及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）有關，ANXA1 可以有效中斷小鼠NF-κB 信號通路。 從而抑制NF-κB 活性，降低促炎介質的產生［9，12］。 VEGF既存在于癌旁組織中，也存在于血清中，不僅可以通過自分泌效應直接刺激肝癌細胞增殖，還能分泌至血清中，間接促進腫瘤血管增生［13］。 研究表明，VEGF 在腫瘤的發生發展過程中起到促進新生血管生成的作用，同時為腫瘤細胞提供必需的氧氣和營養物質［14］。 實驗結果表明，片仔癀可以通過促進肝臟細胞ANXA1 蛋白的表達，下調其下游蛋白VEGF及其受體VEGFR 的表達，抑制血管內皮細胞生長因子分泌作用；同時，其能夠抑制核蛋白NF-κB p50核轉錄水平，通過抑制腫瘤炎癥的作用，發揮其抗肝癌的治療效果。

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

本研究從肝功能切入，觀察片仔癀對肝癌腹水小鼠的肝臟保護作用，從實驗結果可以觀察到片仔癀可減少H22 肝癌小鼠的腹水量， 降低血清ALT、AST 含量，保護肝癌腹水小鼠的肝功能。 經肝臟病理染色顯示，片仔癀組小鼠肝臟中肝索排列紊亂程度較模型組有所改善，肝小葉結構較為清晰，脂肪空泡減少，肝細胞的液化、退變現象明顯比模型組減少，說明片仔癀具有非常明顯的改善肝細胞、保護肝功能的作用［6］。

綜上所述，片仔癀具有良好的保護并改善肝細胞的作用，并且可以通過調控ANXA1／VEGF 通路，進而抑制腫瘤炎癥作用，產生肝保護作用，具有潛在的抗癌作用，可為肝癌的藥物治療開辟新途徑。