半枝蓮誘導大腸癌干細胞凋亡

魏麗慧，張晶晶，王 舒，方 翌，陳友琴，彭 軍，林久茂*

（1. 福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；2. 福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122；3. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122）

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一。 在我國，其發病率和病死率在惡性腫瘤中排第3 位和第5 位［1］。手術、化療和放療仍是臨床上治療大腸癌常用的策略，這些方法雖然能減少腫瘤的體積，但不能有效解決復發、轉移的問題，特別轉移性患者治療后5年的生存率低于50%［2］。 研究發現，大腸癌干細胞是大腸癌細胞中占據一小部分比例的細胞群，具有自我更新、無限增殖的能力，在大腸癌的發生發展以及治療后腫瘤復發、轉移等過程中發揮著關鍵的作用［3-5］。 半枝蓮（Scutellaria barbataD. Don）作為天然藥用植物，具有清熱解毒、利尿、散瘀等功效，臨床多用于治療肺癌、大腸癌等腫瘤性疾病［6-11］。課題組前期研究表明，半枝蓮可通過調節miRNA 及Wnt、HH 等信號傳導通路抑制大腸癌細胞增殖、 腫瘤血管生成和誘導細胞凋亡［12-17］，并且具有抑制大腸癌細胞中干細胞比例的作用［18］，但具體的抑制作用機制尚未闡明。 因此，本文以大腸癌干細胞為切入點，探討半枝蓮對大腸癌干細胞的作用及其調控機制。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物和細胞株 半枝蓮購于福建中醫藥大學國醫堂；人大腸癌SW480 細胞株購于上海中科院細胞庫。

1.2 實驗試劑 Leibovitz’s L-15 培養基、DMEM／F12 培養基、0.25%胰蛋白酶、 胎牛血清、B-27 Sup plement、Antibiotic-Antimycotic、StemPro Accutase cell Dissociation Reagent（美國Thermo Fisher Scientific公司）；AnnexinV-APC／PI 凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；human EGF、human FGFbasic（美國Peprotech公司）；臺盼藍（美國Amresco公司）；mRNA 逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（美國TaKaRa公司）；Bcl-2、Bax、GAPDH、二抗（美國Cell Signaling Technology 公司）。

1.3 實驗儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；二氧化碳培養箱、低速離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；倒置顯微鏡系統（德國Leica公司）；細胞計數儀（美國CountStar 公司）；MOFLO XDP 分選型流式細胞儀（美國Beckman coulter 公司）；Realtime-PCR 儀（美國ABI 公司）；化學發光凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 實驗方法

2.1 常用試劑配制

2.1.1 半枝蓮溶液配制 參考文獻［18］制備半枝蓮乙醇提取物，用DMSO（50%）＋PBS（50%）配制成母液濃度為500 mg／mL 的溶液，超聲溶解后，儲存于-20 ℃冰箱備用。

2.1.2 大腸癌干細胞培養液配制 在無添加胎牛血清的DMEM／F12 培養基中加入20 ng／mL EGF、20 ng／mL bFGF、1×B27 Supplement 和1% Antibiotic-Antimycotic。

2.2 大腸癌干細胞培養 運用SP 細胞分選法分離大腸癌干細胞［19］；分選得到的細胞用PBS 清洗1 次，加入大腸癌干細胞培養液，接種在低粘附6 孔板培養板，放培養箱中常規進行培養。 每兩天添加培養液，當細胞生長至匯合度達80%左右時，加入StemPro Accutase cell Dissociation Reagent（干細胞消化酶）進行消化，觀察細胞變圓且部分漂浮時加入2 倍體積含10% FBS 的L-15 培養液終止消化，1 000 r／min 離心3 min，棄上清，收集沉淀細胞，用干細胞培養液重懸制成單細胞懸液后傳代或接板。

2.3 細胞形態學觀察 將培養后的大腸癌干細胞按1×105個／mL 細胞密度接種于6 孔培養板中，每孔體積為2 mL，置于37 ℃細胞培養箱中培養48 h，分別用不同濃度半枝蓮（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預24 h 后，用PBS 清洗1 次，用倒置顯微鏡觀察細胞密度。

2.4 細胞存活率檢測 上述“2.3”中干預的細胞，拍照后，加入干細胞消化酶進行消化收集細胞，用干細胞培養液進行重懸，取10 μL 細胞懸液與10 μL 0.4%的臺盼藍混勻，加入計數板中，在CountStar 細胞計數儀中計數，計算細胞存活率。

2.5 DAPI 檢測細胞凋亡 用不同濃度半枝蓮干預大腸癌干細胞24 h 后，用PBS 清洗1 次，制成細胞涂片，加入4%多聚甲醛進行細胞固定，15 min 后用PBS 清洗3 次，加入DAPI 溶液孵育15 min，再用PBS 清洗3 次，封片后用倒置熒光顯微鏡進行觀察并拍照。

2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 用不同濃度半枝蓮干預大腸癌干細胞24 h 后，用干細胞消化酶進行消化，收集的細胞用PBS 清洗1 次，加入200 μL 的Assay Buffer 進行重懸，并加入5 μL Annexin V-APC及5 μL PI，室溫避光孵育15 min，再添加200 μL的Assay Buffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.7 Bcl-2、Bax mRNA 檢測 用不同濃度半枝蓮干預大腸癌干細胞24 h 后，加入1 mL 的Trizol，按常規方法提取總RNA，測定濃度后取1 μg 樣本進行逆轉錄， 參考逆轉錄試劑盒步驟； 得到的cDNA按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒的步驟添加PCR 反應液，放入PCR 儀中進行擴增反應，以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCT相對定量計算獲得每組基因表達的水平。

2.8 Bcl-2、Bax 蛋白檢測 以不同濃度的半枝蓮干預大腸癌干細胞24 h 后，離心后去除上清，用PBS（預冷）清洗2～3 遍，加入裂解液RIPA，在冰上裂解15～20 min，用BCA 試劑盒進行濃度的測定。采用10% SDS-PAGE 膠進行電泳（90 V，40 min；120 V，50 min），電泳結束進行轉膜，轉膜后封閉液封閉1～2 h，PBS-T 緩沖液中充分振蕩清洗；根據目的蛋白的分子量加入相應的一抗（Bcl-2、Bax、β-actin）進行孵育，4 ℃過夜。 孵育結束后，采用TBS-T 進行清洗。 加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。 最后用ECL 化學發光法顯色，于化學發光凝膠成像系統檢測蛋白的表達。

2.9 統計學分析 數據采用SPSS 24.0 統計軟件進行處理。 結果用（x±s）表示；先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，滿足條件者，兩組比較采用t 檢驗；未滿足條件者，兩組比較用Wilcoxon 秩和檢驗。

3 結 果

3.1 半枝蓮對大腸癌干細胞生長的影響 不同濃度的半枝蓮處理大腸癌干細胞后，在倒置顯微鏡下觀察大腸癌干細胞的形態變化，結果如圖1 所示，對照組細胞生長較密集， 呈現良好的成球生長，半枝蓮干預后，細胞數量明顯減少，球體變小。

圖1 半枝蓮對大腸癌干細胞生長的影響（×100）

3.2 半枝蓮對大腸癌干細胞增殖的影響 不同濃度的半枝蓮處理大腸癌干細胞后，實驗結果如圖2所示，實驗組與對照組（100%）比較，細胞存活率分別為75.92%、60.02%、41.1%。

3.3 半枝蓮對大腸癌干細胞凋亡的影響 利用DAPI 染色檢測細胞凋亡，結果如圖3 所示，對照組細胞核熒光呈現弱染狀態，隨著半枝蓮濃度的增加，出現核高染的細胞數增加，表明半枝蓮干預可促進大腸癌干細胞凋亡的作用。 此外，我們進一步采用Annexin V-APC／PI 試劑盒檢測半枝蓮對大腸癌干細胞凋亡的影響。 結果見圖4，隨著半枝蓮濃度的增加，凋亡的細胞數目逐漸增多。

3.4 半枝蓮干預對大腸癌干細胞Bcl-2 和Bax mRNA表達的影響 經不同濃度半枝蓮處理大腸癌干細胞24 h 后，如圖5 所示，與對照組比較，Bcl-2／Bax mRNA 的比值隨著半枝蓮濃度的增加，顯著下調。

3.5 半枝蓮干預對大腸癌干細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響 實驗結果如圖6 所示，與對照組比較，半枝蓮干預后，Bcl-2 在蛋白水平的表達顯著下調，但Bax 在蛋白水平表達沒有明顯的改變。 經過蛋白灰度值統計分析，與對照組比較，實驗組的Bcl-2／Bax 比值隨著半枝蓮濃度的增加，顯著的下調；提示，調控Bcl-2 及Bax 兩者之間的平衡可能是半枝蓮誘導大腸癌干細胞凋亡的重要機制。

圖2 4 組大腸癌干細胞活力比較

4 討 論

腫瘤干細胞是腫瘤組織中存在的一小部分細胞，通常處于靜息狀態，當受到外界條件變化如細胞因子刺激時會導致腫瘤的發生、轉移和復發，這均源于腫瘤干細胞擁有很強的自我更新、增殖分化和凋亡抵抗的潛能。 大腸癌發生、復發及轉移的主要原因也是由于大腸癌干細胞的無限增殖分化和強大的抗凋亡特性所導致［3］，故針對大腸癌干細胞治療大腸癌已成為研究的熱點。 臨床常用放療、化療的方式治療大腸癌，但給機體帶來嚴重的副作用。中藥治療腫瘤具有安全、副作用小等優勢，隨著中藥的更深層次研究，其作用機制也越清晰。 因此，進一步加強中藥干預腫瘤干細胞的實驗研究，研制出針對腫瘤干細胞的抗腫瘤藥物，是今后科研工作的主要方向之一。

圖3 DAPI 染色檢測半枝蓮對大腸癌干細胞凋亡的影響（×100）

圖4 4 組大腸癌干細胞凋亡比例比較

圖5 4 組大腸癌干細胞Bcl-2／Bax mRNA 表達比較

圖6 4 組大腸癌干細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達比較

半枝蓮是天然藥用植物，現代多用于臨床輔助治療各種腫瘤性疾病［6-11］，并且具有顯著的療效。基礎研究也表明半枝蓮具有抑制大腸癌細胞增殖及誘導凋亡的作用［12-14］，本課題組前期研究表明半枝蓮具有抑制大腸癌干細胞比例的作用［18］，但具體的抑制作用機制尚未闡明清楚。 因此，本文以大腸癌干細胞為切入點，探討半枝蓮對大腸癌干細胞凋亡的影響及其作用機制。 實驗采用倒置顯微鏡觀察細胞的形態及密度，采用4%臺盼藍檢測觀察半枝蓮對大腸癌干細胞生長的影響，結果均顯示半枝蓮可抑制大腸癌干細胞生長。 同時，利用DAPI 染色及Annexin V-APC 試劑盒檢測半枝蓮對大腸癌干細胞凋亡的影響，發現半枝蓮干預大腸癌干細胞后，細胞凋亡率呈不同程度的增加，由此可知半枝蓮能夠誘導大腸癌干細胞的凋亡。

研究發現腫瘤干細胞凋亡與線粒體外膜通透性（MOMP）有關，MOMP 增大不僅促進腫瘤干細胞的凋亡， 還能通過阻斷腫瘤干細胞信號通路如Wnt、Notch 等通路發揮抑制腫瘤干細胞增殖的作用［19－20］。研究報道，Bcl-2 蛋白家族在線粒體介導腫瘤干細胞凋亡發揮著重要的調節作用［21］。 Bcl-2 家族之間相互作用的異常調節會引起MOMP 的變化，誘導腫瘤干細胞凋亡［20］。 Bcl-2 家族由抗凋亡蛋白（Bcl-2等）、促凋亡蛋白（Bax、Bak 等）以及BH-3 結構域的促凋亡蛋白（Bad 等）組成［21-22］。 其中，Bcl-2 和Bax是最具代表性的抑制和促進凋亡的蛋白，Bcl-2 與Bax 可形成同源（Bax／Bax）或異源（Bcl-2／Bax）的二聚體，共同作用發揮著調節細胞凋亡的作用［23］。 當Bcl-2 高表達和Bax 的低表達， 導致二者的比值上調是細胞發生凋亡抵抗的重要因素。 因此，二者的比值決定了細胞的最終命運［24］。 實驗結果顯示，大腸癌干細胞用半枝蓮處理24 h 后，Bcl-2／Bax 比率顯著降低，提示半枝蓮干預大腸癌干細胞24 h 后可改變Bcl-2、Bax 的mRNA 及蛋白的表達，通過影響兩者之間的平衡，最終誘導細胞凋亡。