HPLC法同時測定茶葉中兒茶素類和咖啡因的含量

楊金川, 白雪梅

(1.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢測檢驗院, 貴州 貴陽 550001; 2.貴州省市場監(jiān)督管理局, 貴州 貴陽 550001)

茶葉起源于中國，是我國豐富的天然資源，并因其具有多種生理作用和藥理活性，受到眾多學(xué)者的關(guān)注，在活性成分茶多酚和咖啡因方面的研究較多。茶多酚(Tea polyphenol)，又稱維多酚，是茶葉中30多種酚類物質(zhì)的總稱，約占茶葉干物質(zhì)總量的25%～35%，主要包括兒茶素、黃酮類化合物、花青素和鞣酸四大類物質(zhì)，其中以兒茶素含量最多，約占茶多酚總量的 65%～80%[1]。茶多酚具有抗衰老、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、降血脂和降血糖等藥理作用[1]，而兒茶素類是茶多酚中的主要成分，也是其主要的藥理活性物質(zhì)，其主要有沒食子酸(GA)、表兒茶素(EC)、兒茶素(+C)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子兒茶素(GC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，因此也是茶葉品質(zhì)和茶多酚產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)；咖啡因(Caffeine)也是茶葉的主要成味物質(zhì)和生理活性成分，具有多種生理作用，能作為藥品使用，具有興奮神經(jīng)樞、強心、促進葡萄糖代謝、利尿、助消化及解毒等功效，但是兒童攝入過量咖啡因可誘使多動，長期食用會產(chǎn)生依賴性[2]。檢測茶葉及茶制品中各種兒茶素及咖啡因的含量對于評價其功能品質(zhì)具有重要意義。

目前，茶葉茶多酚中兒茶素類和咖啡因的檢測主要有高效液相色譜法[3-4]、超高效液相色譜法[5]、液相色譜質(zhì)譜法[6]和超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜[7]等，檢測中多采用梯度洗脫，易出現(xiàn)基線不平、分離度差、重現(xiàn)性差、分析時間長和對檢測設(shè)備要求高等問題。為此，以綠茶和紅茶中GA、GC、EGC、+C、ECG、EGCG、EC、GCG和CAF為研究對象，探索新的色譜分離條件，使得樣品中所有兒茶素類化合物和咖啡因均得到良好的分離，并采用HPLC進行測定，以期為茶葉產(chǎn)品的等級評價和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉樣品：湄潭翠芽、都勻毛尖、云霧毛峰、遵義紅紅茶、紅寶石紅茶，均購于永輝超市。

儀器：Agilent-1260高效液相色譜儀(配UVD) ，安捷倫科技有限公司；Milli-Q Academic超純水儀，密理博中國有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)定溶液的制備 將25 mL EDTA溶液 (10 g/L)、25 mL抗壞血酸溶液 (10 g/L)和50 mL甲醇置于容量瓶中，以超純水定容至500 mL，制得混合溶液。

對照品溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，以甲醇定容配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液。其濃度分別為1.06 mg/mL(GA)、0.2 mg/mL(GC)、2.03 mg/mL (EGC)、1.04 mg/mL (+C)、2.02 mg/mL (CAF)、2.03 mg/mL (EGCG)、1.05 mg/mL (EC)、1.00 mg/mL (GCG)、1.99 mg/mL (ECG)。GA、CAF、EGCG、ECG各取0.50 mL，GC、EGC各取2.00 mL，+C、EC各取1.50 mL， GCG取 1.00 mL，各儲備液混合均勻即得10 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 試樣的制備 準(zhǔn)確稱取0.2 g(精確到0.000 1 g)過40目篩的茶葉粉末置于15 mL離心管中，加入10 mL 70%甲醇，70℃水浴鍋中提取10 min (隔5 min震蕩1次)，于高速離心機中 (低溫5℃，8 000 r/min)離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶。殘渣再用5 mL 70%甲醇重復(fù)提取1次，合并上清液，并用穩(wěn)定溶液定容到25 mL，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.2.3 流動相的選擇 通過查閱文獻資料，梯度洗脫流動相主要分為甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)和乙腈(V)∶酸溶液(V)，通過試驗驗證甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)、乙腈(V)∶酸溶液(V)以及乙腈 (V)∶ 甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)為流動相的分離效果，通過不斷優(yōu)化條件，最終達到最佳色譜條件。

1.2.4 檢測方法 色譜柱： Agilent C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)。檢測波長：275 nm，流速1 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL，在最佳流動相及梯度洗脫條件下進行測定。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL、100 μL、200 μL、400 μL 和500 μL，用穩(wěn)定液定容到1.00 mL 得一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.2.4”檢測條件下進行測定。以峰面積值(y)對進樣濃度(x)進行線性回歸。

1.2.6 重復(fù)性試驗 將混合對照品溶液在最佳流動相及梯度洗脫條件下進行測定。連續(xù)進樣5次，進樣量10 μL。計算峰面積RSD值，考察峰面積的一致性。

1.2.7 加標(biāo)回收試驗 稱取0.2 g(精確到0.000 1 g)茶葉粉末于15 mL離心管中，加入2.00 mL的9種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.2”方法進行加標(biāo)回收試驗，平行進行5次樣品測定，同時做空白樣品試驗，檢測其本底成分，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.8 樣品測定 取貴州市場上常見的湄潭翠芽、都勻毛尖、云霧毛峰、遵義紅紅茶及紅寶石紅茶5種茶葉，以“1.2.2”進行前處理，在最佳流動相及梯度洗脫條件下進行測定，3次重復(fù)，檢測不同茶葉樣品中的兒茶素類和咖啡因含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

試驗表明，當(dāng)流動相為甲醇(V)∶酸溶液(V)時，色譜圖目標(biāo)峰雖然可以分離，但峰型寬，且有一定的拖尾，影響檢測靈敏度；當(dāng)流動相為乙腈∶酸溶液(V)時，色譜圖峰型較好，但EGCG和EC的分離效果不佳；最終結(jié)合甲醇和乙腈對分離度和峰型的特性，通過不斷優(yōu)化條件，最佳梯度洗脫條件為流動相乙腈 (V)∶ 甲醇 (V)∶ 0.5%乙酸 (V)=5∶10∶85，保持5 min；10 min內(nèi)流動相改變?yōu)?0∶20∶70；5 min內(nèi)流動相改變?yōu)?∶20∶72，并保持2 min；最后3 min內(nèi)改變流動相為5∶10∶85，保持1 min，共26 min。從圖1～2可知，在最佳條件下，各目標(biāo)物均有較好的分離度，并和樣品雜質(zhì)有較好的分離效果。

圖1標(biāo)準(zhǔn)溶液中9種化合物的色譜圖

Fig.1 Chromatograms of nine compounds in standard solution

Fig.2 Chromatograms of nine compounds in green tea sample

2.2 線性關(guān)系和線性范圍

從表1可知，GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG的線性范圍分別為2.6～26.5 μg/mL、2.0～20.0 μg/mL、20.3～203.0 μg/mL、7.8～78.0 μg/mL、5.0～50.5 μg/mL、5.1～50.8 μg/mL、7.9～78.8 μg/mL、5.0～50.0 μg/mL和5.0～49.8 μg/mL；相關(guān)系數(shù)分別為0.999 94、0.999 71、0.999 98、0.999 98、0.999 99、0.999 74、0.999 94、0.999 92和0.999 98；檢出限分別為0.15 μg/mL、2.67 μg/mL、2.70 μg/mL、1.06 μg/mL、0.22 μg/mL、0.67 μg/mL、0.92 μg/mL、0.57 μg/mL和0.66 μg/mL。表明，茶葉中9種化合物在給定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度高。

表1茶葉中兒茶素類及咖啡因的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

Table 1 Linear regression equations, correlation coefficients (R2),and limits of detection (LODs) of catechins and caffeine in tea

化合物 Compound線性范圍/ (μg/mL) Linear range線性方程 Linear equation相關(guān)系數(shù)R2Correlation coefficient儀器檢出限/ (μg/mL)LODGA2.6～26.5y=63.684 x-0.2320.999 940.15GC2.0～20.0y=5.631 x-0.7740.999 712.67EGC20.3～203.0y=5.124 x-2.0300.999 982.70+C 7.8～78.0y=12.696 x-1.7950.999 981.06CAF5.0～50.5y=55.207 x-3.5820.999 990.22EGCG5.1～50.8y=26.202 x-12.7560.999 740.67EC7.9～78.8y=12.881 x-0.8550.999 940.92GCG5.0～50.0y=28.001 x-5.5150.999 920.57ECG5.0～49.8y=33.345 x-4.9100.999 980.66

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性 經(jīng)測定， GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG峰面積RSD分別為0.47%、2.12%、0.63%、0.70%、0.48%、1.22%、0.41%、1.36%和0.68%，表明各化合物在最佳色譜條件下檢測擁有良好的重復(fù)性。

2.3.2 精密度與回收率 由表2可知，該方法測定茶葉中兒茶素類及咖啡因的平均回收率為94.68%～104.40%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.89%～5.78%，表明該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

表2 茶葉中兒茶素類及咖啡因的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=5)

2.4 樣品中兒茶素類及咖啡因的含量

從表3可知，5種市售茶葉中，3種綠茶兒茶素類及咖啡因9種化合物均有檢出，但含量存在差異，其中以CAF的含量最高，占9種化合物總含量的32.7%以上；茶多酚以EGCG、EGC、ECG及EC 4種為主，占9種化合物總含量的49.0%以上。2種紅茶僅檢出GA和CAF，其中以CAF的含量最高，占目標(biāo)化合物的93.9%以上。

表3 茶葉樣品中兒茶素類及咖啡因的含量

注：N.D.表示未檢出。

Note: N.D. means non-detected.

3 結(jié)論

在前人的基礎(chǔ)上，研究結(jié)合流動相甲醇和乙腈的特性，優(yōu)化了乙腈∶甲醇∶0.5%乙酸溶液的梯度洗脫方法。在Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，乙腈、甲醇、0.5%乙酸溶液為流動相進行梯度洗脫，柱溫30℃，UV檢測波長為275 nm條件下檢測的各目標(biāo)化合物GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG峰面積RSD值為0.41%～2.12%。樣品加標(biāo)平均回收率為94.68%～104.40%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.89%～5.78%，表明該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。在市售5種茶葉中，綠茶中兒茶素類和咖啡因9種化合物均有檢出，但其含量存在差異，這可能與茶葉的老嫩、茶樹品種及制茶工藝的不同有關(guān)[8]；而2種紅茶僅檢出GA和CAF，表明，綠茶中的兒茶素類化合物明顯高于紅茶，說明紅茶在發(fā)酵過程中會損失絕大部分茶多酚。該結(jié)論與侯冬巖等[9]研究的一致，未經(jīng)發(fā)酵的生茶和經(jīng)過渥堆陳化后的發(fā)酵茶中的化學(xué)成分及其含量有著明顯的區(qū)別。而實際上，茶葉的品種、生長環(huán)境、放置時間及加工過程等，都會對茶多酚的含量有著顯著的影響。