紅、藍光照對大鼠視力早衰和神經網絡的影響

萬 宇 李戰梅 黃 海 黃學文 何藝嵐

(南充市中心醫院眼科，南充 637000)

光環境與人類的生活息息相關，尤其是隨著信息時代的到來，人們對智能手機、平板電腦等設備的依賴程度逐年升高。這些LED屏幕釋放的藍光(400～500) nm不僅對人的視力會產生巨大的危害，眼睛如果長時間接受藍光的刺激，RPE細胞和感光細胞形態學會發生改變，對光的敏感度會下降[1]，抑制RPE細胞生長，最終會導致血-視網膜屏障功能障礙[2]。另一方面，光環境在精神疾病方面也發揮著重要作用。抑郁、焦慮、絕望被視為較為普遍的心理疾病，造成該疾病的原因有生理、外界壓力和性格等，嚴重的可產生自殺行為。此外，隨著近年來對褪黑素分泌研究的不斷深入，有關研究也揭示了光環境與精神類疾病之間的關聯[3-4]。

在前人研究的基礎上，本研究以紅、藍光為刺激光源，按照8 h睡眠/8 h光照刺激/8 h正常光照的生活作息進行時間設置，討論紅藍光照在1 h和8 h對大鼠視網膜SA-β-Gal陽性細胞個數的影響，探究藍光刺激在大鼠視網膜衰老過程中的作用，檢測紅、藍光照刺激下大鼠腦組織中NO、NOS含量，以及初步探討相關視神經傳導通路誘導相關神經網絡的應激反應[5]；通過FSTs研究藍光刺激后，大鼠在絕望環境狀態下的反應，以尋找藍光刺激對視網膜衰老和在精神類發病過程中的影響。結合日常生活中手機和電腦屏幕的大量使用，是否會對視力及精神產生一定的影響，并分析藍光照射是如何通過視力影響神經網絡。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究對象為50只SPF級健康雄性Wistar大鼠，體質量為160～200 g，購于陸軍軍醫大學動物實驗中心，生產許可證號為：SYXK(渝)20170019，實驗動物使用許可證號：SYXK(渝)2017-0005，經檢驗無眼部疾病和精神疾病。大鼠飼養在光照12 h/黑暗12 h周期循環的鼠籠中(60 cm×60 cm×60 cm)，溫度、噪聲和濕度均符合動物實驗室要求范圍，自由進食飼料和飲水。適應性喂養1周后將其按照隨機數字表進行分組，分別為藍光照射1 h(B1組)、紅光照射1 h(R1組)、藍光照射8 h(B2組)、紅光照射8 h(R2組)和空白對照組(Con組)，用苦味酸標記各組序號。

1.2 材料與儀器

10%水合氯醛購自天津市化學試劑廠；SA-β-Gal染色試劑盒購自碧云天生物技術公司；NO和NOS試劑盒購自南京建成生物研究所；OTC包埋液購自Sigma公司；醫用紅、藍光燈管(20 W)購自佛山水之影有限公司；手術器械購自天津醫科大學；722S紫外可見光光度計購自上海精科有限公司；SL8臺式離心機購自Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1光照實驗

將大鼠取出進行光照實驗，通過過濾裝置將6個熒光燈放置在距離實驗大鼠眼睛上方30 cm處，B1、B2藍光照射組在醫用藍光燈下分別照射1 h和8 h，R1、R2紅光照射組在醫用紅光燈下分別照射1 h和8 h，在所有光照試驗中，紅/藍光照脈沖維持在300lx。Con組放置在明暗交替(12 h/12 h)的自然光照下，連續光照刺激12周。

1.3.2強制游泳實驗(FSTs)

每天14:00和16:00進行TSTs實驗，具體方案為將各實驗組大鼠連續2 d在直徑30 cm、高45 cm的樹脂玻璃桶中進行強制游泳操作：將25 ℃淡水倒入桶中，水深25 cm。第1天讓5組實驗大鼠游泳15 min，24 h后進行第2次游泳，游泳時間持續15 min。記錄第1次游泳前5 min靜止不動的總持續時間和第2次游泳靜止不動的總持續時間，并記錄大鼠靜止不動時，頭是否靠在水缸壁上。當大鼠處于行為絕望時，第2次游泳測試中不動性增加則證明第1次測試是行為絕望，第2次測試不動性減少是治療抑郁效果的重要指標之一[6]，因此，兩次游泳測試中數據按照比值進行分析，即第2次不動性/第1次不動性(均值±標準差)[7]。

1.3.3生化指標鑒定

各組大鼠用10%水合氯醛麻醉直至無痛覺反應，迅速取出眼球以及2 mm球后視神經，取B、R實驗組大鼠眼組織部分RPE細胞進行原代培養，采用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)2次消化分離細胞，以0.125%胰酶消化并傳代培養，用免疫組織化學檢測角蛋白與S100表達來鑒定RPE細胞。細胞儲存于-80 ℃冰箱中，復蘇后觀察RPE細胞活性。顯微觀察RPE體外生長狀況：初期為圓型,胞壁內充滿黑色色素, 1 h后貼壁生長，后經傳代復蘇后細胞呈圓型、不規則形，細胞折光性強。免疫組織化學檢測顯示角蛋白與S100均呈強陽性，說明該細胞是RPE細胞,且細胞純度為100%。凍存細胞復蘇后生長旺盛，細胞形態與復蘇前相比無區別[8]。取第3代處于對數生長的RPE細胞，經0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后加10%胎牛血清的DMEM制成3×105個/mL的細胞懸液，接種于24孔培養板，在波長為490 nm處進行吸光值(A值)測定；對眼球組織進行SA-β-Gal免疫組織化學染色，實驗步驟按照文獻[9]操作；取枕葉(位于小腦之上大腦后端)部分，用預冷的PBS沖洗腦中殘血，吸水紙吸干，超聲勻漿后加入PBS，所得組織勻漿進行檢測，硝酸還原酶法檢測NO濃度，比色法檢測NOS濃度，實驗步驟嚴格按照說明書操作。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 RPE細胞增殖能力

以時間為橫軸，平均吸光值為縱軸繪制細胞生長曲線如圖1。對實驗大鼠采用藍、紅光和自然光照射8 h，發現各光原對RPE細胞增殖能力存在不同的影響，大鼠經藍光照射后RPE細胞在第3、4天細胞增殖能力較對照組顯著升高(P<0.05)，與紅光照射組相比無顯著性差異。

圖1 紅、藍光照射組和對照組大鼠RPE細胞的增殖生長曲線Fig.1 Grouw curve of RPE cell in red, blue and contral groups

2.2 FSTs結果

圖2A為不同光照下，各實驗組大鼠在第2次游泳與第1次游泳相比不動性百分比的變化。方差分析發現：與紅光照射、對照組相比，藍光照射大鼠不動百分比顯著降低，且差異具有統計學意義(P<0.05)，而紅光照射與對照組相比無顯著性差異。圖2B表明，與第1次測試結果相比，第2次游泳測試中不同光照刺激下不動性變化的百分比。藍光光照1 h、8h和對照組相比，8 h藍光照射組與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，而1 h藍光光照處理組與對照組無顯著性差異。

圖2 第2次游泳實驗與第1次游泳實驗靜止時間比注：與對照組相比，*P<0.05Fig.2 Percentages of change in duration of immobility in the second forced swim test compared to the first swim testNote：compared with control group，* P<0.05

2.3 不同光源照射對生化指標的影響

通過方差檢驗結果顯示：不同時間不同光照對大鼠RPE細胞SA-β-Gal染色陽性細胞數具有統計學差異(P<0.05)。通過檢測大鼠腦組織中NO和NOS含量發現，實驗組大鼠RPE細胞中SA-β-Gal染色陽性細胞數均顯著高于對照組，且差異具有統計學意義(P<0.05)，說明光照刺激可加速RPE細胞的衰老，進而影響視力。其中藍光照射8 h組與對照組相比，SA-β-Gal染色陽性細胞數顯著增加(P<0.01)；與紅光相比，藍光對細胞的衰老作用更加明顯；與對照組相比，藍、紅光照8 h的NO含量均明顯升高，(P<0.05)，而藍、紅光照1 h與對照組相比，NO的含量無顯著性差異；與對照組相比，藍、紅光照刺激后大鼠枕葉中NOS含量均顯著升高，其差異具有統計學意義(P<0.05)，其中藍光照射8 h組的NOS含量與對照組相比具有較大顯著差異(P<0.01)。

表1 各組大鼠SA-β-Gal染色陽性細胞個數、NO和NOS指標比較Table 1 Comparison of the number of SA-β-Gal staining positive cells, NO and NOS in each group n=10)

3 討論

光照作為臨床上常用的物理治療方法，通過發光裝置產生不同波長和強度的光線，刺激相關部位的神經和組織，調節血液循環的內分泌，此種物理療法無副作用，且操作簡單。不同強度的光，對實驗動物所產生的作用是不同的[10]。藍光波長短，具有較高的組織穿透能力，藍光對于光感受器和RPE細胞有相似的損傷形態，已證實RPE細胞是在藍光波長范圍存在視網膜損傷的基本位點，近紫外線產生的自由基氧化應激在視網膜光化學損傷中占有重要作用，該損傷機制同樣適應于藍光[11]。有研究表明，長時間光照誘導小鼠屈光力向近視方向偏移，晶狀體變薄，玻璃體腔延長，視網膜形態發生改變，后極部鞏膜膠原直徑變小。近期研究發現光照強度可能不會影響眼球正常發育，在長時間光照誘導的小鼠近視形成中并不起重要作用[12]。本實驗使用紅光和藍光為發光源，探究不同時間不同光照刺激大鼠RPE細胞增殖生長曲線。結果表明，8 h藍光照射的大鼠RPE細胞在第3、4天細胞數較對照組顯著增加(P<0.05)，而與紅光照射組相比無顯著性差異，說明一定時長的藍光光照可顯著增強RPE細胞的增殖。隨著視力的下降，不同波長、強度對小鼠睡眠覺醒行為也會產生相應的影響[13]，睡眠不足影響精神中樞神經網絡的傳導，大部分抑郁患者或精神病患者都存在睡眠障礙等問題。

細胞的衰老受細胞分裂次數的限制，當分裂次數達到一定的限度，細胞失去合成DNA和有絲分裂的能力，增殖能力喪失，SA-β-Gal作為體內鑒別細胞衰老的標志，其陽性細胞數可能顯示該細胞衰老程度[14]，通過改進SA-β-Gal染色法在不同年齡獼猴眼切片中發現衰老細胞隨著年齡的增長逐年累積的現象，這為進一步研究體內RPE細胞衰老復制提供了依據[9]。本研究結果發現：光照刺激組大鼠中SA-β-Gal染色陽性細胞數與對照組相比顯著增加(P<0.05)，說明光刺激可以加速大鼠細胞RPE衰老。其中與紅光相比，藍光對細胞的衰老作用更加明顯(P<0.05)。NO、NOS的含量與視網膜神經細胞凋亡基因有關[15]，視覺信息從視網膜感光器到到達枕葉，即枕葉介導視中樞的傳導。本實驗采用試劑盒檢測大鼠枕葉組織中NO、NOS的含量，研究光照對神經網路的影響。結果表明紅、藍光照可上調大鼠腦組織中NO、NOS含量，刺激了相關視神經傳導通路，引起相關神經網絡做出應激反應[16]，其具體機制有待后續深入探討。

視交叉上核通過神經化學參與精神調節，在下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)傳導過程中，神經網絡參與情感行為和精神病理學變化[17]。本實驗采用FSTs法研究紅、藍光照對神經網路的影響，通過分析經光刺激的大鼠在極端環境中的表現，確定刺激條件對大鼠精神網路的影響。研究結果表明，與紅光刺激相比，藍光更容易使大鼠產生絕望的情緒，長時間藍光照射比短時間藍光照射更容易使大鼠產生絕望情緒。光線療法對抑郁癥的作用以及利用LED光譜可調且智能化的優點，根據不同場合和時間段的需求，整合出不同維度的光，給人們帶去舒適的體驗，創造利于身心健康的光環境，從治療和預防兩方面更好控制抑郁癥[18]。由此推想，藍光照射對精神類疾病存在一定影響，并建議人們合理使用電子設備，特別是青少年兒童視力還未完全發育成熟，長時間使用電子設備不僅對視力產生損傷，還會影響神經網絡的健康。