3 種中藥提取物聯用對變形鏈球菌生長的影響＊

王玉帛，楊潔瑩

(蘭州大學口腔醫院,甘肅 蘭州 730030)

齲病是一種口腔慢性感染性疾病,主要表現為牙齒硬組織的慢性進行性病損,具有發病率高、分布廣的特點。據國家衛生與計劃生育委員會發布的第4 次全國口腔健康流行病學調查結果顯示,我國5歲和12 歲兒童患齲率分別為70.9%和34.5%,比10年前分別上升了5.8%和7.8%。齲病與多種因素相關,比如飲食、宿主和時間等,但其最主要病因是口腔特定微生物的感染,其中,變形鏈球菌(Streptococcus mutans,MS)被公認為最主要的致齲微生物,其黏附、聚集于由唾液蛋白所形成的生物膜上,產酸并耐酸,形成酸性微環境從而侵蝕牙釉質造成脫礦進而侵襲牙本質導致齲病的發生[1]。因此,降低致齲細菌數量、減少酸的合成以及阻止菌斑生物膜形成也就成了防治齲病的最為有效的策略。

天然中草藥,如厚樸[2]、金銀花[3]、甘草[4]等因具有較好的抗菌防齲作用而被廣泛報道,但對于多種中草藥聯用防齲的研究和報道很少。本文以變形鏈球菌作為致齲菌的代表,對厚樸酚(Magnolol)、木犀草素(Luteolin)、甘草甜素(Glycyrrhizin)及其混合物的防齲能力進行研究。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

厚樸酚(梯系愛酶化成工業發展有限公司,CAS號為528-43-8)；甘草甜素(梯系愛酶化成工業發展有限公司,CAS 號為1405-86-3)；木犀草素(上海源葉生物科技有限公司,CAS 號為491-70-3)；BHI 培養基 (北京索萊寶生物科技有限公司,LA0360-250g)；全波長酶標儀(Infinite M Nano)；變形鏈球菌(取樣于實驗室自存菌種)；二甲基亞砜(DMSO)；一次性無菌接種環(上海玉博生物科技有限公司)；ZD-85恒溫振蕩器(力辰科技)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅)；生化培養箱(上海培因實驗儀器有限公司)；氯己定漱口水。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備

BHI 培養基(腦心浸液肉湯)制備:將38.5g 腦心浸出液肉湯粉用三蒸水配置成1L 溶液,放入高壓蒸汽滅菌鍋,在121℃滅菌30min。

1.2.2 菌懸液的制備

在生長著變形鏈球菌的BHI 固體培養基上用一次性無菌接種環挑取一個單菌落,接種于3mL BHI 液體培養基中,放在ZD-85 37℃恒溫振蕩器中,復蘇48h,分光光度計調定菌懸液濃度為106CFU/mL (A600=0.2)

1.2.3 實驗藥液的制備

厚樸酚藥液制備:將3.2mg 厚樸酚粉加入到20mL 的DMSO 中,配置成160μg/mL 的厚樸酚儲備液。用BHI 培養基將厚樸酚儲備液濃度等比稀釋,最終配置成（μg/mL）：160、80、40、20、10、5、2.5 的溶液,室溫儲存。

木犀草素藥液制備:將20mg 木犀草素粉加入到20mL 的DMSO 中,配置成1mg/mL 的木犀草素儲備液。用BHI 培養基將木犀草素儲備液濃度等比稀釋,最終配置成（μg/mL）：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 的溶液,室溫儲存。

甘草酸藥液制備:將12mg 甘草酸粉加入到20mLDMSO 中,配置成600μg/mL 的甘草酸儲備液。用BHI 培養基將甘草酸儲備液濃度等比稀釋,最終配 置 成（μg/mL）：600、300、150、75、37.5、18.75、9.375 的溶液,室溫儲存。

以上藥液以體積比1:1 混合時,實際濃度為制備藥液濃度的一半。

1.3 混合液對變形鏈球菌生長的影響

1.3.1 微量肉湯稀釋法

在96 孔板中,以A 液橫向濃度梯度稀釋,加滿八排,B 液縱向濃度梯度稀釋,加滿八列,第九列加入陽性對照(氯己定漱口液加菌液),第十列加入陰性對照(培養基加菌液),第十一列加入空白對照(液體培養基),前十列均加入變形鏈球菌,第十一列僅加入液體培養基的方法,將三種藥液兩兩混合物制板,其中每種藥液體積均為90μl,菌液為20μl。放入ZD-85 恒溫振蕩器,待變形鏈球菌達到對數增長期(11h),先肉眼觀察,再用全波長酶標儀測定其OD 值三次取平均值,使用Graphpad Prism 8 軟件進行Heatmap數據分析,以8 列和H 排的數據,找出三種藥液單獨使用時的MIC 值。實驗做3 次取平均值。

1.3.2 聯合藥敏實驗

在96 孔板中,以A 液橫向濃度梯度稀釋,加滿八排,B 液縱向濃度梯度稀釋,加滿八列,第九列加入陽性對照(氯己定漱口液加菌液),第十列加入陰性對照(培養基加菌液),第十一列加入空白對照(液體培養基),前十列均加入變形鏈球菌,第十一列僅加入液體培養基的方法,將三種藥液兩兩混合物制板,其中每種藥液體積均為90μl,菌液為20μl。放入ZD-85 恒溫振蕩器,待變形鏈球菌達到對數增長期(11h),先肉眼觀察,再用全波長酶標儀測定其OD 值三次取平均值,使用Graphpad Prism 8 軟件進行Heatmap數據分析,以顏色明顯變化的數據作為所需數值。實驗做3 次取平均值。

1.3.3 聯合用藥效果評價

根據單獨用藥和聯合用藥的抑菌效果,計算分級抑制濃度(FIC)指數,從而檢測兩兩之間的抗菌作用關系。FIC 指數=MIC(A 組聯合)/MIC(A 組單用)+MIC(B 組聯合)/MIC(B 組單用)。

當FIC 指數小于0.5 時,兩種藥為協同作用；當FIC 指數為0.5～1 時,兩種藥為相加作用；當FIC 指數大于1 且小于2 時,兩種藥為無關作用；當FIC 指數大于2 時,兩種藥為拮抗作用。

2 結果

經肉眼觀察和Graphpad Prism 8 分析,每個實驗的三次平行對照結果均一致,結果如圖1～3 所示和見表1～3。

表1 甘草甜素與木犀草素聯合的抗菌試驗

表2 甘草甜素與厚樸酚聯合的抗菌試驗

表3 木犀草素與厚樸酚聯合的抗菌試驗

2.1 Heatmap 分析結果

2.1.1 MIC 的測定

木犀草素、甘草甜素、厚樸酚對變形鏈球菌的MIC 分別為（μg/mL）：125、75、20。如圖1～3 所示。

圖1 甘草甜素與木犀草素不同濃度混合液對變形鏈球菌的生長抑制作用

圖2 甘草甜素與厚樸酚不同濃度混合液對變形鏈球菌的生長抑制作用

圖3 木犀草素與厚樸酚不同濃度混合液對變形鏈球菌的生長抑制作用

2.1.2 FIC 指數計算

由表1～3 可知，通過計算厚樸酚、木犀草素、甘草甜素聯合應用的FIC，FIC1=(62.5/125+37.5/75)=1，FIC2=(10/20+37.5/75)=1，FIC3=(62.5/125+10/20)=1，即當各組分的濃度為1/2MIC 時，各組分的濃度縮小2 倍，比單用厚樸酚、木犀草素、甘草甜素時對變形鏈球菌抑制濃度提高了2 倍。該結果表明厚樸酚、木犀草素、甘草甜素分別聯合應用具有良好的相加抗菌作用。

3 討論

3.1 國內外研究進展

厚樸酚能作用于變形鏈球菌的生物膜,抑制變形鏈球菌生物膜中的主要毒力因子ffh、gtf D、pdp的表達水平,通過凝固細菌蛋白、破壞細菌的細胞膜結構,有效抑制變形鏈球菌生長。其次,厚樸酚能抑制葡萄糖基轉移酶活性減少胞外葡聚糖的合成,減緩細菌發酵產酸,降低對牙面的酸蝕破壞程度,從而大量減少變形鏈球菌的黏附聚集[5]。木犀草素可以破壞細菌細胞壁、細胞膜的結構,引起膜電位發生變化、胞內成分的釋放,從而引起營養物質吸收、ATP活性降低等功能性障礙,最終導致菌體死亡[6]。實驗證實,在甘草酸作用下,即使培養基的酸度接近中性,變形鏈球菌的增殖仍受到明顯抑制,說明甘草甜素可能同時抑制了變鏈菌產酸和分裂增殖,提示甘草酸可能對變鏈菌糖轉運過程和/或糖代謝途徑有抑制作用[7,8]。同時其對于變形鏈球菌生物膜的形成也有一定抑制作用[9]。

3.2 不足與展望

本研究表明,厚樸酚、甘草甜素、木犀草素聯合用藥時對口腔內主要致齲菌變形鏈球菌具有良好抗菌性能,且有相加效果。但本實驗只研究了對口腔主要致齲細菌的抑制作用。后期需在動物模型下進行進一步研究,探究其對口腔主要致齲細菌的抑制機制等,為進一步臨床試驗提供基礎。綜上,可將此混合液應用于牙膏、漱口水等口腔清潔產品,發揮其優良性能,在防齲與口腔清潔領域有較好的應用前景。