桑皮止咳方對呼吸道合胞病毒感染后咳嗽小鼠氣道神經源性炎癥的影響

王楠， 白曉紅， 劉芳， 修嬋， 宋金婷， 盛曉丹， 王敏

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽 110847；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽 110032）

感染后咳嗽（post-infectious cough，PIC）[1]是指呼吸道感染急性期癥狀消失后，仍長時間咳嗽，持續時間一般為3～8周。PIC是兒科常見的呼吸系統疾病，亦是引起小兒慢性咳嗽的原因之一。國內外研究表明，PIC占慢性咳嗽的21.72%，在中國兒童慢性咳嗽病因中居第3 位[2]。盡管臨床上感染后咳嗽比較常見，但其發病機制復雜，除與氣道炎癥、氣道黏膜損傷、氣道高反應、咳嗽反射敏感性增高相關，還與神經、內分泌及免疫系統密切相關，各因素之間相關作用，形成復雜的病因網絡。氣道神經源性炎癥是引起氣道敏感性增高的重要因素，而神經生長因子（NGF）是調控氣道神經源性炎癥的關鍵介質[3]。

本研究所用的桑皮止咳方是以《小兒藥證直訣》的瀉白散和《醫學心悟》的止嗽散化裁而來，具有清瀉肺中伏火，兼疏散在表之風邪、化痰止咳之功效，臨床應用20 余年，療效顯著。經前期的臨床和實驗研究證實，該方具有良好的宣肺止咳、化痰平喘、解熱，減輕氣道炎癥反應的作用[4-6]。但其有關氣道神經源性炎癥的機制作用尚不明確，基于此，本研究觀察了桑皮止咳方對呼吸道合胞病毒（RSV）感染后咳嗽小鼠模型肺組織中NGF 表達水平的影響，以探討桑皮止咳方的干預作用及相關氣道神經源性炎癥機制，為該方的臨床應用提供理論和實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1動物與病毒SPF 級6 周齡BALB/c 小鼠96只，雌性，體質量18～20 g，均購于遼寧長生生物技術股份有限公司，動物質量合格證號：SCXK（遼）2015-0001。實驗動物的使用過程中嚴格遵守3R 原則，經遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準[倫理審批編號：21000092018020]。RSV Long株，由武漢大學病毒研究所提供。

1.2藥物與試劑桑皮止咳方組成中桑白皮、地骨皮、苦杏仁、桔梗等中藥材均購于遼寧中醫藥大學附屬醫院草藥局；孟魯司特鈉咀嚼片（英國）（杭州默沙東制藥有限公司分裝），國藥準字J20130053，規格：每片4 mg。辣椒素（批號：A3278）、NGF 抗體免疫組織化學試劑盒（批號：ab52918）均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3儀器超聲霧化器（江蘇魚躍公司，型號：402AI）；離心機（德國Eppendorf 公司，型號：5804R）；顯微鏡（日本Olympus 公司，型號：CX-41）；ATP 700（ST）電腦全自動脫水機（澳大利亞Hestion 公司）；Epoch 酶標儀（美國BioTek 儀器有限公司）；PowerPac Basic電泳儀（美國伯樂公司）。

1. 4分組、造模與給藥（1）分組：按照隨機數字表將96 只小鼠分為正常組、模型組、孟魯司特鈉組、桑皮止咳方低劑量組、桑皮止咳方中劑量組、桑皮止咳方高劑量組，每組16 只。（2）RSV感染后咳嗽模型的復制方法：除正常組外，其他組別小鼠乙醚淺麻醉下經兩側鼻孔緩慢滴入RSV Long株病毒液，50 μL/只。正常組在同等條件下接種等量不含病毒的DMEM，每日1 次，連續接種3 d[7-9]。感染后第13 天以辣椒素霧化刺激，觀察RSV 感染小鼠出現頻繁噴嚏、口鼻分泌物增多、腹肌抽搐、伸出前腳、頸部伸向前、張口等特征性體位的情況。（3）給藥：從感染后第14 天起各組分別灌胃給藥，給藥劑量按“人和動物按體表面積折算的等效劑量折算表”折算。孟魯司特鈉組小鼠給予0.08 g·mL-1灌胃，桑皮止咳方低劑量組小鼠給予0.5 g·mL-1灌胃，桑皮止咳方中劑量組小鼠給予1.0 g·mL-1灌胃，桑皮止咳方高劑量組給予2.0 g·mL-1灌胃。每只小鼠給予0.2 mL·d-1灌胃。正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。連續14 d。同時，觀察小鼠的一般狀態。

1.5觀察指標與方法

1.5.1 咳嗽敏感性的測定 末次（即感染后第28天）給藥30 min 后，將小鼠置于5 L 密閉霧化箱中，以霧化濃度為1×10-4mol/L的辣椒素溶液霧化2 min，再觀察3 min，記錄小鼠的咳嗽潛伏期及次數。

1.5.2 蘇木素—伊紅（HE）染色觀察肺組織病理變化 取經多聚甲醛固定后的小鼠肺組織，經石蠟包埋，切片，烘片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，采用HE染色等處理，封片。光鏡下觀察肺組織炎性細胞浸潤情況。

1.5.3 免疫組織化學法檢測肺組織中NGF蛋白的表達 取固定好的肺組織，常規石蠟包埋、制片（0.45 μm）。枸櫞酸修復后，加內源性過氧化物酶孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈后加體積分數10%胎牛血清孵育20 min，加NGF 抗體（1∶300）4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次3 min，加酶標山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物孵育20 min。PBS 沖洗3次，每次3 min，加入新鮮配制的DAB顯色劑，顯色3 min 后，流水沖洗5 min，蘇木素復染3 min，流水沖洗5 min。梯度酒精、二甲苯脫水透明，封片后光鏡下觀察。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測肺組織中NGF蛋白的表達 將小鼠肺組織自-80 ℃冰箱中取出，勻漿，加入裂解液裂解30 min 后，以12 000 r/min 4 ℃離心15 min。取上清，經BCA 蛋白定量后，加入蛋白上樣緩沖液，沸水中變性5 min，按每孔60 μg蛋白量上樣。12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），恒壓80 V、120 V 電泳分離蛋白，恒流200 mA，50 min后將蛋白轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，麗春紅染色，脫脂奶封閉2 h。NGF（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）等一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次后，二抗孵育1 h，TBST 洗膜3次。將條帶放入曝光儀，加入電化學發光（ECL）液，進行曝光。

1.6統計方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1一般情況正常組小鼠精神狀態良好，反應靈敏，皮毛柔順有光澤，進食、飲水、活動均正常，體質量正常增長；模型組小鼠精神萎靡，反應較為遲鈍，活動少，毛色枯黃暗淡，進食、飲水減少，體質量減輕。

2. 2各組小鼠咳嗽敏感性比較表1 結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠咳嗽潛伏期明顯縮短（P＜0.01），咳嗽次數顯著增多（P＜0.01）。提示PIC 造模成功。與模型組比較，桑皮止咳方低、中、高劑量組和孟魯司特鈉組小鼠咳嗽潛伏期明顯延長、咳嗽次數顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），且桑皮止咳方的作用效果呈劑量依賴性。

表1 各組小鼠咳嗽敏感性比較Table 1 Comparison of the cough sensitivity of mice in various groups （±s）

表1 各組小鼠咳嗽敏感性比較Table 1 Comparison of the cough sensitivity of mice in various groups （±s）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組孟魯司特鈉組桑皮止咳方低劑量組桑皮止咳方中劑量組桑皮止咳方高劑量組N/只16 16 16 16 16 16潛伏期（t/s）121.74±6.84 55.72±8.29①104.66±6.82③67.19±7.77③97.60±5.46③109.65±8.95③咳嗽次數（n/次）31.44±4.35 74.44±6.26①40.13±5.92③68.75±6.59②50.19±4.87③41.81±5.09③

2.3各組小鼠肺組織病理變化比較圖1 結果顯示：正常組小鼠肺組織、支氣管無炎癥細胞浸潤，肺泡壁上皮完整，支氣管壁未見增厚。模型組小鼠肺泡壁上皮細胞受損，肺泡壁、支氣管壁明顯增厚，肺間質可見大量淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性細胞浸潤。與模型組比較，桑皮止咳方低、中、高劑量組和孟魯司特鈉組小鼠肺組織損傷減輕，肺泡壁上皮受損輕微，支氣管壁略見增厚，肺間隔輕度增寬，炎癥細胞浸潤不明顯。

2.4各組小鼠肺組織中NGF蛋白表達量比較表2、圖2 結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠肺組織NGF 表達量均顯著上調（P＜0.01）；與模型組比較，桑皮止咳方低、中、高劑量組和孟魯司特鈉組小鼠肺組織NGF表達量下降（均P＜0.01），且桑皮止咳方的作用效果呈劑量依賴性。

2. 5各組小鼠肺組織中NGF蛋白相對表達量比較圖3結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠肺組織NGF 蛋白表達量顯著上調（P＜0.01）；與模型組小鼠肺組織比較，桑皮止咳方低、中、高劑量組和孟魯司特鈉組小鼠肺組織NGF蛋白表達量下降（均P＜0.01），且桑皮止咳方的作用效果呈劑量依賴性。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of lung tissue in mice of various groups（by HE staining，×400）

表2 各組小鼠肺組織中NGF蛋白表達量比較Table 2 Comparison of the relative expression level of NGF in lung tissue of mice in various groups （±s）

表2 各組小鼠肺組織中NGF蛋白表達量比較Table 2 Comparison of the relative expression level of NGF in lung tissue of mice in various groups （±s）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組孟魯司特鈉組桑皮止咳方低劑量組桑皮止咳方中劑量組桑皮止咳方高劑量組N/只16 16 16 16 16 16 NGF（A/μm2）91 794.38±8 816.41 816 286.40±88 872.49①317 594.60±50 345.16②647 733.36±70 229.77②481 081.24±46 261.27②385 223.33±35 981.07②

圖2 各組小鼠肺組織NGF陽性表達比較（免疫組織化學染色，×400）Figure 2 Comparison of the positive expression of NGF in lung tissue of mice in various groups（by immumohistochemical staining，×400）

3 討論

感染后咳嗽（PIC）是一種常見的呼吸系統疾病，絕大部分由呼吸道病毒感染引起，其中呼吸道合胞病毒（RSV）最為常見。RSV感染可以引起氣道上皮細胞壞死、脫落，使感覺神經末梢充分暴露，炎癥介質大量釋放，這些炎癥介質作用于氣道平滑肌細胞、上皮細胞等，引起氣道平滑肌痙攣，從而出現咳嗽敏感性增高、神經源性炎癥、氣道高反應等[10]。可見，氣道神經源性炎癥在PIC的發生發展中發揮重要的作用。

NGF 作為連接神經系統及免疫系統的橋梁，對神經細胞的生長、分化、調節均起到調控的作用，并且對免疫系統和炎癥網絡動態平衡也起到重要的調節作用[11]。NGF 作為神經和免疫雙調控因子，通過誘導神經炎癥反應參與了PIC 的發病[10]。本研究結果顯示，RSV感染后咳嗽小鼠肺組織中NGF 表達明顯升高，經孟魯司特鈉和桑皮止咳方的干預后NGF蛋白表達明顯下降。

PIC屬中醫學“慢性咳嗽”范疇。小兒慢性咳嗽多為急性呼吸道感染后，外邪未盡，郁熱內留于肺，導致咳嗽纏綿。而且內有郁熱的小兒更易于招致外邪，患兒常兼外感風邪導致咳嗽時輕時重。桑皮止咳方是以《小兒藥證直訣》的瀉白散和《醫學心悟》的止嗽散化裁而來，由蜜桑白皮、地骨皮、苦杏仁、桔梗等中藥組成。方中：蜜桑白皮為君，瀉肺止咳，利水消腫；地骨皮為臣，涼血除蒸，清肺降火。君臣配伍，既清肺中實火又瀉肺中郁熱而止咳。苦杏仁降氣平喘，桔梗宣肺祛痰，兩藥升降共筑，調節肺之宣發肅降。諸藥相伍，共奏清肺經郁熱，瀉肺中虛火，疏散在表未盡之余邪，恢復肺之正常宣肅功能，而達到止咳功效。縱觀全方，既能清瀉肺中實火又可瀉肺中伏火，兼有疏散在表之風邪、化痰止咳之功效，配伍得當，效果益彰。經前期的藥理實驗研究證實，該方具有明顯的鎮咳、抗炎和免疫調節作用。本研究首先通過辣椒素誘咳實驗對PIC 模型小鼠咳嗽敏感性進行了測定，結果顯示：模型小鼠咳嗽潛伏期明顯縮短，咳嗽次數明顯增多，咳嗽敏感性增加；分別給予孟魯司特鈉和桑皮止咳方治療后，桑皮止咳方低、中、高劑量組和孟魯司特鈉組小鼠咳嗽潛伏期顯著延長，咳嗽次數顯著降低，咳嗽敏感性降低。這進一步支持了桑皮止咳方對PIC 主癥咳嗽治療作用確切的結果。以免疫組織化學、Western Blot 法檢測小鼠肺組織中NGF 蛋白表達的結果顯示，模型組NGF 表達量顯著增高，桑皮止咳方低、中、高劑量組和孟魯司特鈉組NGF 表達量均明顯降低，表明桑皮止咳方能抑制PIC小鼠肺組織NGF的表達。

綜上所述，桑皮止咳方能顯著降低RSV 感染后小鼠咳嗽敏感性，其機制可能與抑制肺組織NGF 蛋白的表達，減少肺組織的炎性浸潤，降低氣道神經源性炎癥，進而調控神經與免疫系統的交互作用有關。

圖3 各組小鼠肺組織中NGF蛋白相對表達量比較Figure 3 Comparison of the relative expression level of NGF in lung tissue of mice in various groups（±s，p）