高強度間歇訓練對武警戰士T淋巴細胞穩態的影響

彭 朋，王大寧，秦永生，薄 海，孫伯貽

T淋巴細胞是免疫系統的重要組成部分，包括輔助性T(T helper，Th)和細胞毒性T(cytotoxic T lymphocytes，Tc)兩個亞群，Th細胞可繼續分化為Th1[主要分泌干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)]、Th2[主要分泌白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)]、Th17[主要分泌IL-17A]和調節性T(regulatory T，Treg)[主要分泌轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)]四個亞群。Th各亞群彼此間相互協調、相互制約并形成Th1/Th2和Th17/Treg平衡，在維持機體免疫穩態中發揮重要調控作用[1]。

當前，部隊軍事訓練負荷(包括負荷量和負荷強度)和難度不斷加大，長時間大負荷訓練后感染性疾病發生率增加，即運動性免疫抑制。課題組前期研究發現，武警戰士連續3 d大負荷訓練后機體出現明顯的免疫抑制，其機制之一可能與運動性低血睪酮與高皮質醇血癥有關[2]。因此，適時監測戰士的免疫功能對于避免運動性免疫抑制、過度疲勞等相關訓練傷病具有重要意義。近年來，競技與軍事體育領域興起一種省時有效的運動方式——高強度間歇訓練(high-intensity interval training，HIIT)。本研究旨在探討急性(1次)和短期(4周)HIIT對T淋巴細胞穩態平衡的影響，為科學合理安排訓練以及預防運動性免疫抑制提供依據。

1 對象與方法

1.1 受試對象 選取某部隊武警男性戰士23名，均為第3～4年兵，年齡(23.8±2.2)歲，身高(1.73±0.06)m，體重(75.3±5.1)kg。受試者具有較高的軍事素質(均為訓練標兵)，身體健康，均無心血管疾病、糖尿病、慢性感染、骨骼肌肉病史及其他嚴重疾患病史，無常規用藥史，無煙酒嗜好。

1.2 HIIT方案 參照課題組前期建立的方法[3]在400 m標準跑道進行HIIT。利用心率貯備(heart rate reserve，HRR)百分比估算靶心率以確定運動強度，靶心率的計算公式：[(220-年齡)-靜態心率]×(60%～80%)+靜態心率。受試者先進行10～15 min熱身(慢跑和拉伸)，隨后開始正式訓練，即以90%～95%HRR強度快跑3 min，然后以45%～50%HRR強度慢跑3 min，共完成6組，3次/周，共4周。訓練過程中佩戴遙測心率表(Polar FT1，芬蘭)實時監測受試者心率以控制運動強度在靶心率范圍內。

1.3 流式細胞術檢測淋巴細胞亞群分型 分別于第1次HIIT(記作HIIT1)運動前(pre)、運動后即刻(p0)、運動后60 min(p60)及末次HIIT后48 h安靜狀態下(post)靜脈取血10 ml，肝素抗凝。取100 μl抗凝血，加2 ml紅細胞裂解液，與CD3-PerCPeFluor710(總T細胞)、CD4-APCeFluor780(Th細胞)、CD8-V500(Tc細胞)、CD56-FITC(NK細胞)、CD19-PE(B細胞)、CD161-FITC(Th17細胞)、CD25-PerCP-Cy5.5和CD127-PE-Cy7(Treg細胞)單克隆抗體避光孵育20 min，300 g離心5 min。用2 ml PBS緩沖液洗滌后離心5 min。美國產FACSCantoTM II型流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群分型。

1.4 T淋巴細胞體外刺激實驗 利用佛波醇乙酯/離子霉素激活T細胞，通過表面受體表達和細胞因子產生檢測免疫應答功能和穩態平衡。相應的抗體包括：細胞因子IFN-γ-FITC(Th1亞群)、IL-4-PE(Th2亞群)、IL-17A-PE(Th17亞群)、TGF-β-FITC(Treg亞群)，以及Treg細胞活化標志物CD39-APC、潛在相關多肽(latency-associated peptides，LAP-PE)和糖蛋白A重復序列(glycoprotein A repetitions predominant，GARP-APC)。取抗體與相應細胞亞群(見1.3)避光孵育后用流式細胞儀(FACSCantoTM Ⅱ型，美國)檢測陽性細胞與陰性細胞的分群情況，以陽性細胞率(即陽性細胞數占總細胞數的百分比)代表相對表達量。用未經激活的全血作為平行對照。

2 結 果

未經佛波醇乙酯/離子霉素刺激時，T淋巴細胞穩態平衡標志物(表面受體和細胞因子)均無顯著性變化。刺激實驗后，不同T淋巴細胞亞群特異標志物的表達量存在差異。

2.1 Th1/Th2 HIIT1后即刻CD4+、CD8+、CD8high和CD8lowT細胞IFN-γ顯著上調(P<0.05)，60 min時較運動后即刻降低(P<0.05)。HIIT1后各T淋巴細胞亞群IL-4表達量在各時間點差異均無統計學意義，4周HIIT前后各T淋巴細胞亞群IFN-γ和IL-4表達量差異亦無統計學意義(表1)。

表1 23名武警戰士一次急性HIIT對Th1/Th2平衡的影響

注：pre，訓練前；p0，一次HIIT后即刻；p60，一次HIIT后60 min；Post,4周訓練后；與pre比較，①P<0.05，與p0比較，②P<0.05

2.2 Th17/Treg HIIT1后60 min時Treg細胞GARP、LAP和CD39表達升高(P<0.05)。4周HIIT后Treg細胞LAP表達下調(P<0.05)。本研究未檢測出Th17分泌的IL-17A以及Treg分泌的TGF-β(表2)。

表2 23名武警戰士一次急性HIIT對Th17/Treg平衡的影響

注：pre，訓練前；p0，一次HIIT后即刻；p60，一次HIIT后60 min；Post,4周訓練后；與pre比較，①P<0.05，與p0比較，②P<0.05；“-”表示未檢出

3 討 論

3.1 急性HIIT對T淋巴細胞穩態平衡的影響 研究證實，長時間(≥1 h)高強度運動抑制Th1增殖與分化[4, 5]，但短時間(≤30 min)高強度運動對Th1/Th2穩態平衡的影響卻結論不一。在本研究中，HIIT1后即刻IFN-γ表達上調，IL-4并無顯著性變化，提示Th1/Th2平衡向Th1漂移。HIIT1后60 min，IFN-γ和IL-4與運動前均無統計學差異，說明Th1/Th2穩態平衡在運動后1 h恢復正常。

1次急性運動能夠改變Th17/Treg穩態平衡，影響效果依賴于運動強度和持續時間。Perry等[6]發現，長時間高強度訓練后Treg計數下降，T細胞趨向于分化為Th17且IL-17A分泌增多。有趣的是，馬拉松比賽后，血漿和尿中IL-17A出現暫時性下降[7]。令人意外的是，本研究并未檢測出IL-17A和TGF-β表達，可能是健康成年人外周血中Th17和Treg細胞含量甚微，很難檢測出相應的細胞因子水平。由于Treg細胞具有抑制其他免疫細胞并維持免疫穩態和免疫耐受的作用[8]，我們進一步測定Treg早期活化標志物，結果發現，GARP、LAP和CD39在HIIT1后即刻無顯著性變化，60 min后均表達上調，提示HIIT對Treg功能的影響具有滯后效應。

TGF-β是Treg分泌的特異細胞因子，其作為抑制因子能夠調節免疫功能、維持免疫耐受[9]。TGF-β合成后在粗面內質網經過二聚化和蛋白水解后形成無活性的潛在TGF-β(latent TGF-β)，后者由LAP與活性TGF-β以1∶1的比例以非共價鍵結合而成，該蛋白復合體不能與TGF-β受體結合，因此不能發揮生物學活性。當復合物離開粗面內質網后轉運至細胞表面，LAP被錨定蛋白GARP識別并結合，隨后LAP被蛋白酶切割并分離出有活性的TGF-β[9]。GARP在Treg靜息狀態下呈低表達，激活后表達迅速上調，隨后潛在TGF-β分泌增加。由于潛在TGF-β與LAP結合形成復合體，故本研究并未檢測出有活性的TGF-β，然而LAP的表達可間接反映潛在TGF-β的變化。HIIT1后60 min時Treg細胞CD39表達上調，提示HIIT還可通過腺苷途徑介導免疫抑制。外源性ATP水解生成腺苷需要CD39參與[10]，腺苷則可抑制Th17分化并通過下調促炎性因子和趨化因子表達而減輕炎性反應[10]。

本研究結果提示，1次急性HIIT引起T細胞穩態暫時性失衡(Th1/Th2平衡向Th1漂移)，運動后恢復期Treg合成潛在TGF-β并促進ATP分解為腺苷，分別通過抑制T細胞分化和抑制炎性反應而重建T細胞穩態。

3.2 短期(4周)HIIT對T細胞穩態平衡的影響 張宏杰等[11]發現，大學生籃球運動員16周高強度集訓期間，細胞免疫功能削弱，白細胞IFN-γ不變而IL-4表達上調，提示Th1/Th2平衡向Th2方向漂移。Gholamnezhad等[12]證實，Wistar大鼠11周中等強度運動后IFN-γ/IL-4比值升高，而高強度運動后則顯著性下降。陶占泉等[13]發現，青年男性5周遞增負荷運動訓練促使Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)細胞因子基因表達均顯著增加，但以Th1細胞因子為甚，免疫穩態平衡趨向Th1極化；規律太極拳運動上調IFN-γ/IL-4比值[14]，Treg計數及其分泌的細胞因子增加[15]。上述研究提示，規律中等強度運動能夠通過改善免疫平衡協調能力進而提高免疫功能，而反復力竭性運動則導致免疫穩態失衡及免疫功能抑制。然而本研究結果顯示，IFN-γ、IL-4表達量在訓練前后均無統計學差異(IL-17A和TGF-β未檢測到)，提示4周HIIT后T細胞穩態平衡并未發生明顯改變，可能與運動時間較短(4周)以及檢測方法和手段等因素與前人研究存在差異有關。

此外本研究還發現，Treg細胞LAP表達量在4周HIIT后降低，由于LAP與TGF-β結合形成潛在TGF-β，因此LAP下調可能伴隨潛在TGF-β分泌減少，從而導致Treg細胞免疫抑制功能下降。Horwitz等[16]證實，IL-2信號通路調控Treg細胞的活化與增殖進而促進TGF-β分泌增多；有研究發現，6周遞增負荷運動下調淋巴細胞IL-2表達[17]。據此推測，短期HIIT通過降低IL-2分泌量而下調TGF-β表達，Treg細胞LAP隨之減少。上述結果提示，短期反復HIIT后Treg細胞免疫抑制能力減弱，可能是免疫系統對規律訓練的適應性反應，同時也是免疫功能增強的標志之一。然而長期(>4周)HIIT對免疫穩態的影響及機制尚不得而知，需要延長運動干預周期進一步證實。

1次急性HIIT暫時性改變Th1/Th2穩態并使Th1/Th2平衡向Th1漂移，運動后恢復期具有免疫抑制作用的Treg細胞被動員，其作用可能參與了T細胞穩態的調節與重建；短期(4周)HIIT誘導Treg細胞免疫抑制能力減弱，但對T細胞穩態平衡并無顯著影響。