提前復(fù)蘇D3胚胎對不同年齡段患者臨床結(jié)局的影響

李玉虎，于萍，李寧，蔡雪想，張留光

(海口瑪麗醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，海口 570100)

胚胎冷凍及復(fù)蘇技術(shù)已經(jīng)成為最重要的輔助生殖技術(shù)衍生手段之一，它可以使患者在更合適的時(shí)期接受胚胎移植，提高累積妊娠率。影響凍融胚胎移植(FET)周期臨床妊娠率的因素主要包括：患者年齡、胚胎質(zhì)量、冷凍方法、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)目及胚胎與內(nèi)膜發(fā)育的同步性等[1-4]。近年來有關(guān)提前復(fù)蘇卵裂期胚胎(D3胚胎)是否有助于提高胚胎著床率和臨床妊娠率的觀點(diǎn)仍存在爭議。有研究者認(rèn)為提前復(fù)蘇冷凍胚胎有助于提高臨床妊娠率[5-7]，但也有研究者持反對意見[8-9]。之前的研究多集中于提前復(fù)蘇與當(dāng)日復(fù)蘇之間的比較，而忽略了年齡因素對妊娠結(jié)局的影響。因此，本研究對本中心不同年齡段患者提前復(fù)蘇移植周期和當(dāng)日復(fù)蘇移植周期的妊娠結(jié)局進(jìn)行回顧性分析與比較，探討提前復(fù)蘇胚胎對不同年齡段患者妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2015年5月至2018年3月在本中心行FET助孕治療的581個(gè)周期的臨床資料，其中154個(gè)自然周期，427個(gè)人工周期，共復(fù)蘇1 267枚胚胎，移植1 267枚。

納入標(biāo)準(zhǔn)：選擇女方因盆腔、輸卵管、排卵障礙等因素不孕，男方少、弱、畸精子癥、無精子癥等因素不育，以及不明原因致不孕不育的FET周期；排除移植單個(gè)卵裂期胚胎，女方子宮內(nèi)膜異位癥、宮腔粘連等影響著床因素的FET周期。

二、研究方法

1.分組：將納入研究的FET周期按照不同的胚胎復(fù)蘇時(shí)間分為兩組：當(dāng)日復(fù)蘇的為A組，提前18 h復(fù)蘇的為B組；又按照女方年齡不同分為3個(gè)年齡段組：≤35歲、36～40歲和>40歲，比較不同年齡各組中A、B兩組的妊娠結(jié)局。

2.冷凍與復(fù)蘇：采用玻璃化冷凍和解凍試劑盒(Kitazato，日本)進(jìn)行胚胎的冷凍與復(fù)蘇，冷凍與復(fù)蘇步驟嚴(yán)格按照本中心常規(guī)操作和試劑盒說明書進(jìn)行。在室溫條件下，將胚胎放在ES液面上，讓其自然下沉，大約7 min后將胚胎轉(zhuǎn)入VS液中，在不同位置吹吸，最后將胚胎轉(zhuǎn)移到玻璃化冷凍載桿上(Kitazato，日本)并迅速投入液氮中保存，胚胎從轉(zhuǎn)入VS液到投入液氮中的時(shí)間間隔不超過1 min(50～60 s)。復(fù)蘇時(shí)，將載體從液氮中取出并迅速浸入提前37℃預(yù)熱的TS液中，1 min后將胚胎轉(zhuǎn)移至DS液，3 min后轉(zhuǎn)入WS1液，5 min后轉(zhuǎn)入WS2液，5 min后再轉(zhuǎn)入含10%人血清替代品的培養(yǎng)基中(Quinn’s 1029，SAGE，美國)，在37℃、6%CO2及5%O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。提前復(fù)蘇的胚胎大約培養(yǎng)18 h，當(dāng)日復(fù)蘇的胚胎大約培養(yǎng)2 h。

3.內(nèi)膜準(zhǔn)備：根據(jù)患者自身?xiàng)l件不同，內(nèi)膜準(zhǔn)備方案分為自然周期和人工周期兩種。自然周期適用于月經(jīng)期規(guī)律的患者，于月經(jīng)第10天開始B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及內(nèi)膜厚度，綜合LH、E2及孕酮(P)水平確定排卵時(shí)間[10]，排卵后第3天進(jìn)行胚胎移植。人工周期適用于排卵障礙、月經(jīng)不規(guī)律、自然周期內(nèi)膜發(fā)育欠佳者，從月經(jīng)周期第2～3天起口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，先靈，德國)，根據(jù)B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度酌情調(diào)整戊酸雌二醇劑量，至內(nèi)膜≥8 mm時(shí)肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥，40～60 mg/d)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，3 d后移植。兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的授精方式既有體外受精(IVF)也有卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)，之后在B超引導(dǎo)下進(jìn)行胚胎移植。所有FET移植周期冷凍復(fù)蘇胚胎均為優(yōu)質(zhì)D3胚胎(D1～D2發(fā)育正常，D3卵裂球數(shù)目為7～9個(gè)，卵裂球大小均勻或大致均勻，碎片<20%)且復(fù)蘇后無損傷。

4.妊娠判斷及觀察指標(biāo)：胚胎移植第14天測定血清β-HCG值，>25 U/L為生化妊娠；第35天行陰道超聲檢查示宮內(nèi)有孕囊者為臨床妊娠。孕囊數(shù)≥2個(gè)為多胎妊娠。B超隨訪有胎心搏動者為繼續(xù)妊娠，無胎心搏動者為早期流產(chǎn)。

觀察指標(biāo)：胚胎著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，多胎率=多胎周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)胚胎數(shù)/著床胚胎數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組患者一般資料比較

納入研究的581個(gè)FET周期，共復(fù)蘇1 267枚胚胎，移植1 267枚，平均移植(2.2±0.4)枚胚胎；患者平均年齡(35.9±5.2)歲，平均不孕年限(5.7±4.4)年，平均內(nèi)膜厚度(9.6±1.6)mm。581個(gè)周期中當(dāng)日復(fù)蘇的共233個(gè)周期，提前18 h復(fù)蘇的共348個(gè)周期。各不同年齡組之間的自然周期比例、平均年齡、內(nèi)膜厚度、原發(fā)不育比例、ICSI比例和平均移植胚胎數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者的基本特征比較[(±s)，n(%)]

二、各不同年齡組中A、B兩組的妊娠結(jié)局比較

與A組比較，B組的整體胚胎著床率(33.9% vs. 22.3%)、臨床妊娠率(54.0% vs. 42.1%)和多胎率(32.4 vs. 18.4%)顯著升高(P<0.05)。各不同年齡組中，≤35歲組中B組的胚胎著床率(47.3% vs. 31.1%)、臨床妊娠率(68.3% vs. 53.0%)和多胎率(43.6% vs. 20.8%)顯著高于A組(P<0.05)；36～40歲組中，B組的胚胎著床率(30.3% vs. 19.1%)和臨床妊娠率(53.2% vs. 36.5%)顯著高于A組(P<0.05)，但兩組的多胎率(20.7% vs. 22.6%)比較無顯著性差異(P>0.05)；>40歲組中，A組和B組的胚胎著床率、臨床妊娠率和多胎率比較均無顯著性差異(P>0.05)。各不同年齡組中A、B組間的流產(chǎn)率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者FET臨床結(jié)局的比較(%)

注：與同組中A組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

胚胎冷凍與解凍方法、解凍后胚胎質(zhì)量、患者年齡、移植時(shí)子宮內(nèi)膜厚度及同步性是影響FET結(jié)局的重要因素[1-4，11]。對于提前復(fù)蘇凍融胚胎是否能提高FET周期的種植率和臨床妊娠率，目前尚有爭議，原因可能與研究的樣本量大小、樣本納入標(biāo)準(zhǔn)、胚胎冷凍方法及患者年齡分布等有關(guān)。另外，也可能與各生殖中心對移植時(shí)期的選擇，即子宮種植窗與胚胎發(fā)育同步性的評估有關(guān)。以前研究多集中于提前復(fù)蘇與當(dāng)日復(fù)蘇之間的比較，而忽略了年齡對著床率及妊娠結(jié)局的影響。

因此，本研究對本中心不同年齡段患者提前復(fù)蘇移植周期和當(dāng)日復(fù)蘇移植周期的妊娠結(jié)局進(jìn)行了回顧性分析與比較，結(jié)果顯示：在平均年齡、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、原發(fā)不孕比例、ICSI比例和平均移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的情況下，提前18 h復(fù)蘇D3卵裂期胚胎能顯著提高胚胎著床率、臨床妊娠率和多胎率；在患者年齡≤40歲的兩個(gè)FET組中，提前復(fù)蘇D3胚胎能顯著提高胚胎著床率和臨床妊娠率，隨著年齡的升高，胚胎著床率和臨床妊娠率明顯下降。當(dāng)患者年齡>40歲時(shí)，兩組之間的著床率和臨床妊娠率無顯著性差異，提前復(fù)蘇不能提高胚胎的種植潛能。提前復(fù)蘇D3胚胎能顯著提高≤35歲組患者FET周期的著床率，從而引發(fā)多胎率的升高，高達(dá)43.6%。多胎妊娠的母嬰并發(fā)癥，如：妊娠高血壓綜合征、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、低體重兒、流產(chǎn)、早產(chǎn)及胎膜早破、胎兒畸形、雙胎輸血綜合征、羊水過多、羊水栓塞、胎盤早剝及產(chǎn)后出血等[12]的發(fā)生率較單胎妊娠高數(shù)倍，減少移植胚胎數(shù)是降低多胎妊娠的關(guān)鍵因素。有研究表明，卵裂期凍融胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)后，卵裂球恢復(fù)程度高或有融合細(xì)胞階段的胚胎，能獲得更好的種植率和妊娠率[13]。因此，對年齡≤35歲患者的FET周期，可選擇移植單個(gè)生長較好或融合階段的胚胎，以降低多胎妊娠的發(fā)生。

解凍胚胎移植時(shí)機(jī)的選擇也是FET是否成功的重要因素之一，只有當(dāng)胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜同步時(shí)才有可能妊娠。研究表明，提前解凍發(fā)育相對較慢的胚胎(4～6個(gè)細(xì)胞)，可獲得理想的妊娠率[14-15]。對于發(fā)育速度相對慢的胚胎，如果在移植日當(dāng)天解凍，子宮內(nèi)膜發(fā)育的速度可能較胚胎快，導(dǎo)致胚胎與內(nèi)膜的發(fā)育不同步，從而降低胚胎的著床率。而提前復(fù)蘇發(fā)育速度相對慢的胚胎可使胚胎與子宮內(nèi)膜的發(fā)育相對同步，從而提高胚胎的著床率。本研究發(fā)現(xiàn)提前復(fù)蘇D3正常發(fā)育速度的優(yōu)質(zhì)胚胎，其著床率也較當(dāng)日解凍胚胎顯著提高。其原因可能為：部分解凍胚胎透明帶偏硬或發(fā)育潛能差的胚胎需要較長時(shí)間從透明帶中孵出，而過夜培養(yǎng)能提供相對長的時(shí)間使囊胚孵出并著床于同步的子宮內(nèi)膜；體外培養(yǎng)的胚胎發(fā)育落后于體內(nèi)發(fā)育，而復(fù)蘇的胚胎具有一段時(shí)間的靜止期，提前復(fù)蘇有利于調(diào)整胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育的時(shí)間差，使兩者盡可能達(dá)到同步化，實(shí)現(xiàn)成功著床；提前復(fù)蘇可能使囊胚提前孵出，使胚胎與子宮內(nèi)膜窗口期有相對長的接觸時(shí)間，種植率也可能提高。

提前復(fù)蘇D3胚胎不能改善40歲以上患者FET周期的妊娠結(jié)局，原因可能為高齡患者卵巢功能減退，卵子質(zhì)量和數(shù)量下降，造成獲卵數(shù)和可用胚胎數(shù)減少，且高齡女性容易發(fā)生胚胎染色體異常，導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛能差、妊娠率低和流產(chǎn)率高，提前復(fù)蘇也不能改善40歲以上患者胚胎種植率低的事實(shí)[1]。此外，高齡女性卵子中的氧自由基增加，引起卵子線粒體數(shù)量和功能的異常，使得受精卵的非整倍體率增加、胚胎發(fā)育潛能下降及子宮內(nèi)環(huán)境相對較差等，導(dǎo)致自然流產(chǎn)率增高[16]。本研究結(jié)果也顯示，隨著年齡的增加自然流產(chǎn)率也隨之增高，>40歲患者的流產(chǎn)率達(dá)50%左右，提示改善高齡患者的臨床結(jié)局是輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn)。

綜上所述，提前復(fù)蘇D3胚胎不增加FET周期的流產(chǎn)率；提前18 h復(fù)蘇D3胚胎可顯著提高年齡≤40歲患者FET周期的著床率和臨床妊娠率，對年齡>40歲的患者則無明顯影響；同時(shí)提前復(fù)蘇能顯著提高年齡≤35歲患者的多胎率，提示臨床工作中應(yīng)減少這部分患者FET周期的移植胚胎數(shù)，以獲得理想的臨床結(jié)局。