常規IVF完全/部分受精失敗后行早期補救ICSI的應用

王雪瑩，謝聰聰，姚冠峰，郭曉麗，張麗，張玉，劉效群

(河北省計劃生育科學技術研究院，河北省生殖醫院，國家衛生健康委員會計劃生育與優生重點實驗室/河北省生殖醫學重點實驗室，石家莊 050071)

隨著輔助生殖技術的迅速發展，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)臨床治療方案和胚胎實驗室技術也日益完善，但是仍然無法避免在傳統IVF治療中完全受精失敗(TFF)或受精率低的風險[1]。受精失敗的解決辦法目前只有兩個，對于短時受精失敗或者受精率低的可以在受精4～6 h實施早期補救卵胞漿內單精子注射(R-ICSI)，對于常規的隔夜受精失敗可以實施晚期補救ICSI(L-ICSI)。有研究表明，由于L-ICSI胚胎發育潛能較低和子宮內膜異步化，其妊娠結局相對較差[2]。故L-ICSI可能不是TFF的最佳選擇。

R-ICSI是在受精4～6 h觀察第二極體排出的情況，對于TFF采取挽救性ICSI。眾所周知，卵母細胞的質量會隨著時間的延長而下降，對于TFF的患者R-ICSI是一個有效的補救辦法，能獲得更好的妊娠結局[3]。短時受精不僅可以通過R-ICSI有效地避免TFF，縮短精卵共孵育時間，也有助于消除精子和顆粒細胞代謝降解產物對卵母細胞潛在的負面作用，避免卵子老化，提高胚胎發育潛能，保證胚胎種植與內膜發育的同步性[4]。受精4～6 h早期機械性的剝除吸附的卵丘細胞，觀察卵子第二極體排出，可能影響胚胎發育潛力[5]。考慮到卵母細胞損傷的潛在風險和額外費用的增加，未將常規ICSI技術作為非男性因素不孕患者的主要受精方法。短時受精聯合R-ICSI可有效避免不明原因或原發不孕以及不孕時間較長的患者出現TFF或受精率低的情況。因此，本研究探討短時受精聯合R-ICSI在IVF失敗和低受精周期中對胚胎發育潛能和臨床妊娠結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2012年1月至2017年12月在本醫院生殖中心行IVF-ET治療的2 811個周期的臨床資料。根據受精情況將患者分為3組：R-ICSI組：IVF周期中，受精4～6 h后，觀察第二極體排出情況，對于受精6 h后第二極體排出率低于30%者實施R-ICSI(共210個周期)；常規IVF組：常規體外短時受精(共2 062個周期)；ICSI組：直接進行ICSI(共539個周期)。

二、研究方法

1.促排卵方案：采用常規促排卵方案，主要有長方案、拮抗劑方案、微刺激方案以及高孕激素狀態下促排卵方案等。結合血清性激素水平和B超監測卵泡發育情況，當1～2個卵泡直徑≥18 mm或者3個及以上卵泡直徑≥17 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)，35～36 h后取卵，卵母細胞常規實驗室培養2～6 h。

2.精液處理和受精：男方禁欲3～7 d，取卵日手淫取精，待精液完全液化充分混勻后根據精子計數、濃度、活力予以密度梯度離心聯合上游法或簡單洗滌處理精液。在覆蓋礦物油的培養基行常規IVF，將處理后精子密度調至2×105/ml，HCG后40 h左右受精；行ICSI者，用透明質酸酶去除顆粒細胞，HCG后40 h左右行ICSI。

3.受精情況：我中心均執行短時受精，無隔夜受精孵育者。IVF組：IVF后4～6 h去除卵母細胞周圍的顆粒細胞，置于培養液微滴中觀察第二極體的排出情況。R-ICSI組：對于受精6 h后第二極體排出率低于30%者，或者成熟卵母細胞均未排出第二極體者，行R-ICSI。直接ICSI組：取卵后1～2 h給予透明質酸酶剝除卵母細胞周邊顆粒細胞，對于所有MⅡ卵母細胞行ICSI。

4.胚胎發育：IVF受精后18～20 h觀察原核，見到雙原核且看到兩個極體為正常受精。受精后第3天根據卵裂球均勻度、碎片比例和發育速度等進行胚胎質量評估。Ⅰ級：8～10細胞；卵裂球大小均勻、形態規則，透明帶完整；胞質均勻清晰；胚胎內碎片<5%。Ⅱ級：≥6細胞；卵裂球大小略不均勻、形態略不規則；胞質可有顆粒現象；胚胎內碎片5%～15%。Ⅲ級：D3≥4細胞；卵裂球大小不均勻、可有形態不規則；胞質可有粗顆粒現象；胚胎內碎片16%～25%。Ⅳ級：卵裂球大小極不均勻；胞質有嚴重粗顆粒現象；胚胎內碎片>30%；或存在多核現象。Ⅰ級和Ⅱ級為優質胚胎；Ⅰ～Ⅲ級為可利用胚胎。胚胎利用率(%)=(Ⅰ級+Ⅱ級+Ⅲ級胚胎數)/受精數×100%。

5.觀察指標及妊娠判斷：觀察指標包括平均獲卵數、移植胚胎數、MⅡ率、受精率、2PN率、優胚率、著床率、臨床妊娠率等。其中MⅡ率=成熟卵子數/獲卵數×100%，IVF組受精率=受精數/獲卵數×100%，R-ICSI和ICSI組受精率=受精數/MⅡ數×100%，2PN率=2PN數/受精數×100%，多PN率=多PN數/受精數×100%，優胚率=優胚數/受精數×100%，可利用胚率=可利用胚數/受精數×100%，著床率=著床妊娠囊數/移植胚胎數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/(新鮮移植周期數+解凍移植周期數)×100%。

妊娠判斷：移植后14 d測血和尿β-HCG陽性為生化妊娠，第28天B超見孕囊確診為臨床妊娠。

三、統計方法

結 果

一、患者一般情況比較

3組患者的平均年齡比較無顯著性差異(P>0.05)。R-ICSI組原發不育比例顯著高于IVF組(P<0.05)，但與ICSI組比較無顯著性差異(P>0.05)。R-ICSI組的繼發不育比例顯著低于IVF組(P<0.05)，與ICSI組比較亦無顯著性差異(P>0.05)。IVF組和R-ICSI組中女方因素不育比例顯著高于ICSI組(P<0.05)，IVF組和R-ICSI組中男方因素不育比例顯著低于ICSI組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般資料的比較[(±s)，n(%)]

注：與IVF組比較，*P<0.05；與R-ICSI組比較，#P<0.05

二、實驗室指標及妊娠結局的比較

3組患者的平均獲卵數、移植胚胎數及MⅡ率比較均無顯著性差異(P>0.05)。R-ICSI組患者的受精率顯著高于IVF組和ICSI組(P<0.05)；R-ICSI組患者的2PN率顯著低于ICSI組(P<0.05)，但與IVF組比較無顯著性差異(P>0.05)；R-ICSI組的多PN率顯著高于ICSI組，顯著低于IVF組(P<0.05)；R-ICSI組的優胚率、可利用胚胎率及臨床妊娠率均顯著低于IVF組和ICSI組(P<0.05)；R-ICSI組的著床率顯著低于IVF組(P<0.05)，但與ICSI組比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 患者實驗室指標和妊娠結局的比較[(±s)，%]

注：與R-ICSI組比較，*P<0.05

討 論

受精是一個復雜的過程，包括精子獲能、精子與卵母細胞復合體的相互作用、精子與透明帶的結合、頂體反應、精子與卵母細胞融合、卵母細胞激活和原核形成等重要環節。在此過程中，體外培養環境的任何變化都可能影響受精過程和胚胎發育。目前輔助生殖領域的促排卵方案和胚胎實驗室技術不斷完善，但常規IVF過程中仍不能完全避免TFF[6]。

之前研究表明，受精4～6 h后，觀察第二極體排出情況，對沒有排出第二極體的卵母細胞，采用R-ICSI會獲得較好的妊娠結局[7-8]。史鴻志等[9]的研究結果顯示，在受精后4 h，觀察到第二極體的卵母細胞中，93.3%的卵母細胞和隔夜受精情況沒有顯著差異。提示短時受精可以作為一種評估早期受精發生的方法，同時為有效補救未受精卵提供了機會。然而對TFF或受精率低的周期進行R-ICSI會大大增加實驗室的工作量。常規IVF中任何一個環節的異常都可能導致受精失敗，ICSI可克服某些常規IVF受精失敗的因素，提高受精率，但是ICSI過程中可能會損傷卵子，且ICSI跳過了正常受精對精子活力的自然篩選的過程，可能會將染色體異常的精子注射到卵子中，遺傳給子代[10]。所以，受精方式的選擇仍然需要謹慎。

我們的結果顯示R-ICSI組原發不孕的比例顯著高于常規IVF組，但與直接ICSI組比較無顯著性差異，這與之前的研究結果[11]一致。Dodds等[12]的研究也表明，原發不孕患者TFF的風險較高，而不明原因不孕患者TFF的發生率可高達17.6%～25%。其發生可能與一些潛在原因有關，包括受精缺陷、內分泌紊亂、免疫/遺傳和生殖生理缺陷、透明帶硬化或減數分裂紊亂等[13-16]。

短時受精的安全性和有效性目前仍存在爭議。短時受精與隔夜受精相比，清除卵母細胞周圍的顆粒細胞更加困難。卵母細胞在受精早期由于紡錘絲和微管活躍變得更加脆弱，重復的吹吸卵母細胞可能會對卵母細胞結構的完整性造成不利影響，從而降低其對多精的防御能力[5]。然而，Zhang等[17]的分析表明，與隔夜受精比較，短時受精可以提高臨床妊娠率和胚胎種植率。有文獻報道常規IVF多PN受精的比例一般為2%～30%[18-19]，我們的結果顯示R-ICSI后的多PN率為4.82%，高于ICSI組(1.49%)，但低于IVF組(8.58%)，和林碎玲等[20]報道的8.03%大體一致，但高于王巍等[21]報道的6.04%。異常受精率有所升高可能與HCG日E2值較高、HCG日直徑≥14 mm的卵泡率低、獲卵數多、成熟卵母細胞數多及精子優化后濃度高和活動率高有關，也可能是由于精卵共孵育后部分已受精的卵母細胞第二極體排出延遲，此時再行R-ICSI，可能導致多PN形成。我們將進一步總結數據，分析多PN產生的原因。

綜上，本研究結果顯示，IVF完全/部分受精失敗后行R-ICSI的2PN率、優胚率、可利用胚率及臨床妊娠率都有明顯升高。提示常規IVF受精失敗及低受精的患者行早期R-ICSI可有效克服受精障礙，顯著提高受精率，且不影響胚胎的發育潛能，可獲得良好的妊娠結局。因此，在IVF-ET周期中可以通過短時受精聯合早期R-ICSI技術，改善TFF和低受精率患者的臨床結局。