黃連素對妊娠期糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響及機制

孫田歌，孟凡華，楊敏，趙紅梅，于志艷，張瑞，臧淑妃

復旦大學附屬上海市第五人民醫院，上海200240

妊娠期糖尿病(GDM)是一種慢性低度炎癥性疾病。多項研究顯示，GDM患者IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α、CRP等促炎因子水平升高，炎癥狀態的激活導致胰島素抵抗的發生，胰島素抵抗是妊娠期糖尿病患者的顯著特征。中性粒細胞是第一個對炎癥作出反應的免疫細胞[1～3]，近年研究發現，中性粒細胞可以促發機體發生慢性低度炎癥狀態[4, 5]。中性粒細胞分泌一種促炎性蛋白酶，稱為中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)。而絲氨酸蛋白酶抑制劑α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)是一種NE的內源性抑制劑。研究發現，黃連素可以顯著改善2型糖尿病、肥胖、多囊卵巢綜合征等患者的代謝紊亂。但其在GDM中的作用少有研究。2018年5月～2019年8月，我們通過高脂喂養及間斷小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導的方法建立了GDM大鼠模型，探討黃連素對GDM大鼠肝臟組織NE的影響及其對胰島素抵抗的改善作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 SPF級6周齡清潔級雌性SD大鼠30只，10周齡雄性大鼠15只，體質量340～380 g，購自南京動物模式研究所，許可證號：SCXK(蘇)2010-0001。STZ購自美國Sigma公司；高脂高膽固醇飼料(20%蛋白質、50%碳水化合物、21%脂肪和0.21%膽固醇)購自New Brunswick公司；黃連素購自美國Sigma公司；免疫組化一抗(抗NE兔多克隆抗體)購自英國Biorbyt公司；免疫組化二抗(山羊抗兔IgG)購自麥約爾生物公司(HSA0003)；ELISA試劑盒購自美國R&D公司；TRIzol購自Ambion公司；逆轉錄試劑盒和SYBR Green試劑盒購自Invitrigen公司；Western一抗稀釋液和二抗稀釋液購自碧云天公司(P0023A)。

1.2 動物分組及GDM模型構建 30只雌性大鼠適應性飼養1周后，隨機分為對照組10只、GDM組8只、黃連素干預組8只。對照組用普通飼料和普通飲用水喂養4周，GDM組和黃連素干預組用高脂飼料喂養4周。4周后，將各組大鼠按雌雄比2∶1的比例合籠交配，第2天檢栓及陰道涂片檢查，確定為妊娠第0天(D0)。確認妊娠大鼠后，模型組大鼠在D0時腹膜內注射20 mg/kg STZ(0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液pH 4.5配制)構建GDM模型。STZ誘導72 h后檢測血糖水平，連續檢測3次，以血糖>16.7 mmol/L確定為GDM大鼠，并再次予以腹腔內注射10 mg/kg STZ。對照組分別在D0和D3時腹腔內注射同等容量的生理鹽水。造模后繼續高脂飼料喂養。

1.3 干預方法 造模后，黃連素干預組予以黃連素100 mg/kg，分3次每日灌喂，共15 d。對照組、GDM組予以相同方法使用同等容量生理鹽水灌喂。

1.4 檢測指標

1.4.1 血糖及胰島素抵抗指數(IR) 分別于大鼠妊娠D0、D4、D8、D12、D16和D19時予以剪尾，使用羅氏血糖儀檢測監測血糖，直至大鼠分娩。于D0、D8、D16和D19時空腹采血，采用電化學發光法(羅氏 cobas e602，瑞士)檢測大鼠胰島素水平，應用穩態模型評估法計算IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.4.2 血脂、肝功能指標 各組大鼠分別于D0和D19時禁食12 h，尾靜脈斷尾采血，分離血清，-20 ℃保存，采用全自動生化分析儀(Sysmex XN9000，日本)測定血總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。

1.4.3 體質量、胎鼠體質量及胎盤體質量 于D0和D19稱取大鼠體質量。各組大鼠于D19時，水合氯醛麻醉，剖腹切除子宮兩側子宮角，從子宮中取出胎鼠、胎盤并稱重。

1.4.4 肝臟組織NE蛋白表達 ①免疫組化法：由肝左葉固定部位取材，一塊3 mm × 3 mm放入4%甲醛固定液中，制備肝臟石蠟切片，行免疫組化染色，用400倍顯微鏡觀察。以胞質或胞膜染色呈棕黃色為陽性細胞。以0.01 mmol/L PBS代替一抗作為空白對照。②Western blotting法：取肝臟組織，投入液氮中。肝臟組織勻漿后，提取肝臟組織總蛋白，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、封閉、抗原抗體反應、放射自顯影，檢測肝臟組織NE及β-actin蛋白表達量。

1.4.5 肝臟組織NE、α1-AT水平 采用ELISA法。提取各組肝臟組織，標本勻漿上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟完成加樣后，酶標儀在450 nm波長處測量每孔OD值，根據標準曲線計算出各樣品中NE和α1-AT水平。計算NE/α1-AT比值。

1.4.6 肝臟組織促炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)及TNF-α mRNA表達 采用PCR法。應用TRIzol提取各組肝臟組織標本總RNA，采用超微量核酸測定儀測定RNA濃度，選取RNA OD260/OD280比值1.8～2.0的樣品，嚴格按照RT-PCR試劑盒和SYBR Select Master Mix試劑盒說明書進行逆轉錄及擴增，以β-actin作為內參基因。PCR引物序列來自Pubmed，由上海生物工程技術有限公司合成，序列如下：β-actin上游5′-CTGGCTCCTAGCACCATGAA-3′，下游5′-CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′；MCP-1上游5′-TCTCTCTTCCTCCACCACCAT-3′，下游5′-GCTCTCCAGCCTACTCATTGG-3′；TNF-α上游5′-AAGGGAGAGTGGTCAGGTTG-3′，下游5′-TCTGTGAGGAAGGCTGTGC-3′。用2-ΔΔCq方法計算mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 各組血糖、IR變化比較 D0時，各組血糖及IR差異無統計學意義(P>0.05)。D4時，GDM組血糖高于對照組(P均<0.05)，黃連素干預組血糖及IR與GDM組相比差異無統計學意義(P>0.05)。D8之后各時點，黃連素干預組血糖及IR均低于GDM組(P均<0.05)。見圖1。

注：A為各組血糖變化;B為各組IR變化。與對照組比較，#P<0.05；與GDM組比較，*P<0.05。

圖1 各組血糖、IR變化情況

2.2 各組體質量、血脂、肝功能指標比較 D0及D19時，GDM組和黃連素干預組大鼠體質量、TC、TG、ALT、AST均高于對照組(P均 < 0.05)；而D0及D19時,黃連素干預組大鼠上述指標與GDM組大鼠比較,差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組體質量、血脂、肝功能指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 各組胎鼠體質量及胎盤質量比較 D19時，GDM組胎鼠體質量及胎盤質量均高于對照組，黃連素干預組胎鼠體質量及胎盤質量均低于GDM組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組胎鼠體質量及胎盤質量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與GDM組比較，△P<0.05。

2.4 各組肝臟組織NE表達比較 ①免疫組化法：對照組肝臟組織幾乎沒有NE顯色，GDM組有較多的NE表達，黃連素干預組NE表達明顯減少，見圖2。②Western blotting法：分析亦顯示了上述類似結果，GDM組NE表達高于對照組，黃連素干預組NE表達低于GDM組(P均<0.05)，見圖3。

圖2 各組肝臟組織NE表達情況(免疫組化法，×40)

2.5 各組肝臟組織NE、α1-AT水平及NE/α1-AT比值比較 GDM組NE水平高于對照組，α1-AT水平低于對照組，NE/α1-AT比值高于對照組(P均<0.05)。黃連素干預組NE水平低于GDM組，α1-AT水平高于GDM組，NE/α1-AT比值低于GDM組(P均< 0.05)。見圖4。

注：與對照組比較，*P< 0.01；與GDM組比較，△P< 0.01。

圖3各組肝臟組織NE表達情況(Western blotting法)

注：A為各組NE比較;B為各組α1-AT比較;C為各組NE/α1-AT比較。與對照組比較，*P< 0.01；與GDM組比較，△P< 0.01。

圖4 各組肝臟組織NE、α1-AT水平及NE/α1-AT比值比較

2.6 各組肝臟組織MCP-1及TNF-α mRNA表達比較 GDM組MCP-1、TNF-α mRNA表達均高于對照組，黃連素干預組MCP-1、TNF-α mRNA表達均低于對照組(P均< 0.05)。見圖5。

注：A為各組MCP-1比較;B為各組TNF-α mRNA表達比較。與對照組比較，*P< 0.01；與GDM組比較，△P< 0.01。

圖5 各組肝臟組織MCP-1及TNF-α mRNA表達比較

3 討論

隨著人們生活水平的提高，肥胖發生率的升高，GDM的發生率也在不斷的上升，妊娠期高血糖不僅會增加母兒圍生期疾病危險，而且將來母兒患2型糖尿病、心血管疾病的機會明顯增加。制作病理生理過程與人類相似的疾病模型對于疾病機制及治療的研究至關重要。僅僅通過STZ誘導的動物模型通常更類似1型糖尿病，無法模擬以胰島素抵抗為主的GDM臨床特征，胎兒往往出現胎兒宮內生長受限。故本課題組首先通過高脂飼料喂養導致大鼠肥胖，形成一定的胰島素抵抗后再予以小劑量STZ誘導，另外由于大鼠的自我修復能力較強，部分大鼠在成模后第4天出現血糖恢復的情況，我們在成模后第3天予以更小劑量STZ補充注射，使大鼠血糖維持穩定，并提高了大鼠的成模率。

胰島素抵抗是GDM患者的顯著病理生理特征。但目前針對GDM患者的治療唯一安全有效的藥物只有胰島素，而胰島素并不能改善GDM患者的病理生理狀態。而且部分研究顯示胰島素可能增加患者體質量[6, 7]。二甲雙胍可以改善胰島素抵抗，但因其可以透過胎盤[8]，有導致胎兒早產及增加后代體質量的不良影響[9]。所以亟需尋找安全有效，可以改善GDM患者病理生理紊亂的藥物。

黃連素是從多年生草本植物黃連、三角葉黃連或云連的根莖，即黃連中提取到的一種有效化學成分，另有多種植物中也含有黃連素。由于其天然，毒副作用小，應用前景極其廣闊，具有降血糖、降血脂和改善胰島素抵抗的作用。既往研究顯示，黃連素可以通過抑制炎癥因子改善肥胖及2型糖尿病胰島素抵抗。Jiang等[10]研究證實，黃連素可以通過使IκB-β第181位氨基酸殘基磷酸化而抑制NF-κB；而Xie等[11]發現，黃連素還可以通過抑制Rho GTP酶信號通路抑制NF-κB，進而減少炎癥因子的釋放。此外黃連素還可以通過AMPK通路抑制巨噬細胞分泌促炎因子誘導型一氧化氮合酶、環氧合酶2[12]。黃連素已經被證實在治療與胰島素抵抗為主要特征的疾病時(如2型糖尿病、高脂血癥、多囊卵巢綜合征等)具有良好療效。本研究旨在GDM大鼠模型中觀察黃連素對其胰島素抵抗的作用。本研究顯示，GDM組體質量、TC、TG、ALT、AST及IR均高于對照組，GDM組胎鼠體質量及胎盤質量均高于對照組，表明GDM大鼠體質量、血糖、血脂均顯著升高，并出現肝功能異常、嚴重胰島素抵抗，導致其胎鼠出生體質量及胎盤質量均顯著升高；黃連素干預組體質量、TC、TG、ALT、AST及IR均低于GDM組，胎鼠體質量及胎盤質量均低于GDM組，表明黃連素干預后對GDM大鼠具有顯著改善胰島素抵抗、降血糖和降低胎鼠體質量的作用。

慢性低度組織炎癥是系統性胰島素抵抗的重要原因，并且是肥胖和2型糖尿病患者胰島素敏感性下降的關鍵因素[13, 14]。研究發現，中性粒細胞激活后將募集巨噬細胞和抗原呈遞細胞產生大量TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子[15～17]。MCP-1屬于趨化因子CC亞族成員，其高表達可通過促進單核細胞和巨噬細胞遷移和浸潤導致慢性低度炎癥的發生，既往有學者研究發現其在非酒精性脂肪肝、肥胖、糖尿病等胰島素抵抗相關性疾病中高表達[5]，與本研究結果相一致。Mansuy-Aubert等[5]在高脂飼料喂養小鼠肝臟組織中發現中性粒細胞浸潤，并通過分泌NE，降低胰島素受體底物1導致胰島素抵，而NE敲除小鼠炎癥反應明顯減輕，胰島素敏感性增加。Maria等[18]的體外研究顯示，GDM患者的中性粒細胞活性增加，中性粒細胞胞外陷阱和NE水平升高。所以NE可能在導致胰島素抵抗中起著非常重要的作用。而與NE對應的α1-AT則是保護組織免受絲氨酸蛋白酶損害的的一種物質[5]。本研究發現，GDM組NE水平高于對照組，α1-AT水平低于對照組，NE/1-AT比值高于對照組，提示GDM大鼠存在NE過度分泌的情況，作為與其對應的抗炎因子α1-AT則明顯下降，NE/α1-AT升高；黃連素干預組NE水平低于GDM組，α1-AT水平高于GDM組，NE/α1-AT比值低于GDM組，提示黃連素干預后上述指標均有明顯改善，炎癥因子表達的不平衡現象也得到了改善；GDM組MCP-1、TNF-α mRNA表達均高于對照組，黃連素干預組MCP-1、TNF-α mRNA表達均低于對照組，提示妊娠期糖尿病大鼠肝臟組織NE/α1-AT比例的失衡可能促進了單核細胞和巨噬細胞的募集，導致過多的促炎因子的釋放，進而導致大鼠胰島素抵抗的發生，而黃連素可能正是通過改善上述通路發揮其有效作用，而不是通過調節血脂紊亂實現的。