龍井茶多酚提取物對小鼠肝Cyp450酶表達的影響

呂樂，任紅，孫海燕

1深圳職業技術學院 博士后創新基地，廣東深圳518055；2深圳職業技術學院 深圳市發酵精制檢測系統重點實驗室

茶葉有很好的抗氧化、抗腫瘤、改善心血管疾病等保健功能[1]。茶多酚是其主要活性成分，含量占茶葉干重的15%～30%，主要由兒茶素、黃酮類、酚酸類和花色素四大類物質組成[2]。茶葉按照發酵程度和制法分為全發酵茶(如滇紅紅茶)、半發酵茶(如鐵觀音烏龍茶)和非發酵茶(如綠茶)[3]。Cyp450s廣泛存在于動植物和微生物組織中，參與內、外源性物質代謝。臨床90%以上藥物的代謝都有Cyp3A4、Cyp1A2、Cyp2C9和Cyp2D6這四個亞型的參與[4]。小鼠和人的藥物代謝酶基因具有同源性，即小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22相當于人Cyp3A4、Cyp1A2、Cyp2C9和Cyp2D6[5]。Cyp450s個體差異和變異性大，易受外源物質影響[6]。我們前期研究顯示，鐵觀音茶多酚提取物能夠顯著改變小鼠肝Cyp450s的活性和表達[7]。2015年9月～2017年5月，我們以C57BL/6小鼠為研究對象，從基因和蛋白水平上，觀察不同劑量和不同給藥時長龍井茶多酚提取物對小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37和Cyp2d22的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與動物 二級龍井茶葉，購于杭州西湖，烘干，粉碎，過80目篩，常溫避光在干燥罐保存。SPF級雌性C57BL/6小鼠80只，7～8周齡，體質量(18±2)g，購于南方醫科大學實驗動物中心[許可證號SCXK(粵)2016-0041]，飼養條件為相對濕度50%～60%、溫度20～25 ℃，光照/黑暗各12 h。

1.1.2 試劑與儀器 Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22多克隆兔抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(Abcam公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)；LightCycler 1.5熒光定量PCR儀(Roche公司)；電泳系統、轉膜系統、全自動凝膠成像儀[Bio-Rad生命醫學產品(上海)有限公司]；Spectra Max M5e多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 龍井茶多酚的提取方法及成分檢測

1.2.1 龍井茶多酚提取方法 龍井茶多酚提取物的提取參照國家標準(GBT8313-2018)并根據實驗室條件稍作調整：取20 g過篩的龍井茶粉末，按1∶25(w/v)的比例加入70 ℃預熱的70%甲醇，70 ℃水浴浸提30 min。浸提后，將體系冷卻至室溫，布氏漏斗抽濾，濾渣繼續重復浸提2次。合并3次的濾液，旋轉蒸發濃縮至濾液原體積的15%～20%，確保甲醇幾乎被除盡，濃縮液采用氯仿3∶1(v/v)萃取一次，分層后棄去氯仿層，采用旋轉蒸發將水萃取層濃縮至原體積的5%，再用適量超純水復溶。10 000 r/min，低溫離心15 min，上清液冷凍干燥后，常溫避光干燥保存。采用Folin-Ciocalteu法[8]測定龍井茶多酚提取物中總多酚的含量為(123.68±3.39)沒食子酸當量(mg GAE/g DW)。

1.2.2 龍井茶多酚成分檢測[9]采用HPLC法檢測龍井茶多酚提取物中的主要酚類物質，其中含量較高的成分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)288.83 μg/mg(占28.88%)、表沒食子兒茶素(EGC)57.74 μg/mg(占5.77%)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)42.08 μg/mg(占4.21%)、表兒茶素(EC)21.14 μg/mg(占2.11%)等。

1.3 龍井茶多酚提取物對小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37和Cyp2d22的影響觀察

1.3.1 以龍井茶多酚提取物不同劑量為分組的設計 取40只小鼠，隨機分為空白組、75 mg/kg組、150 mg/kg組、300 mg/kg組，每組10只。龍井茶多酚提取物組給予75、150、300 mg/(kg·d)灌胃，空白對照組給予超純水0.1 mL/(10 g·BW)灌胃，各組連續灌胃7 d。

1.3.2 以龍井茶多酚提取物不同給藥時長為分組的設計 取另外40只小鼠，隨機分為對照組、7 d組、14 d組、28 d組，每組10只。7 d組、14 d組、28 d組以龍井茶多酚提取物150 mg/(kg·d)分別灌胃7、14、28 d，對照組給予超純水0.1 mL/(10 g·BW)灌胃28 d，在灌胃2 h之后正常進食、飲水。

1.4 肝臟Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22 mRNA表達檢測 采用real-time PCR法。在末次灌胃2 h后處死各組小鼠，迅速分離肝臟，用預冷的生理鹽水洗凈血跡，濾紙拭干水跡，-80 ℃凍存備用。稱取-80 ℃凍存的小鼠肝臟組織約50 mg，按Takara UNIQ-10柱式TRIzol法提取總RNA，并測定總RNA濃度。按PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒操作，將RNA逆轉錄成cDNA。之后采用SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)試劑盒進行相對定量。肌動蛋白(β-actin)作為內參基因，所有操作在冰上進行。采用比較閾值法(2-ΔΔCt)法定量。引物序列[10～12]見表1。

表1 Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22引物序列

1.5 肝臟Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22蛋白表達檢測 采用Western blotting法。稱取-80 ℃凍存的小鼠肝臟組織約80 mg，加入預冷的NP40裂解液1 mL，于冰上操作，FastPrep-24勻漿，4 ℃，12 000 r/min，30 min，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，將樣品蛋白濃度調整至5 mg/mL，按4∶1加入5×loading buffer，100 ℃加熱5 min，冰上冷卻，離心，混勻，分裝，-80 ℃放置備用。取出-80 ℃凍存的制備好的蛋白樣品，100 ℃再次加熱5 min。冰上冷卻混勻。制膠、上樣5 μL、電泳、轉膜、封閉、一抗(GADPH、Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22)孵育、二抗孵育、顯影成像。顯影后將所得的蛋白質條帶用Image Lab 5.1軟件分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。方差同質性檢驗數據的方差齊性，方差齊時進行單因素方差分析。單因素方差分析后采用LSD進行多重比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量龍井茶多酚提取物對Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22的影響

2.1.1 對Cyp3a11 mRNA及蛋白表達的影響 與空白組相比，300 mg/kg組Cyp3a11 mRNA表達降低，75 mg/kg組、150 mg/kg組Cyp3a11蛋白表達均降低(P均<0.05)。見圖1。

注：A為Cyp3a11的mRNA相對表達水平,B為Cyp3a11的蛋白相對表達水平;與空白組比較，*P<0.05。

2.1.2 對Cyp1a2 mRNA及蛋白表達的影響 與空白組相比，150 mg/kg組Cyp1a2 mRNA及蛋白表達均增高(P<0.05)。見圖2。

2.1.3 對Cyp2c37 mRNA及蛋白表達的影響 與空白組相比，150 mg/kg組、300 mg/kg組Cyp2c37 mRNA及蛋白表達均降低(P均<0.05)。見圖3。

注：A為Cyp1a2的mRNA相對表達水平,B為Cyp1a2的蛋白相對表達水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖2 不同劑量龍井茶多酚提取物對Cyp1a2 mRNA及蛋白表達的影響

2.1.4 對Cyp2d22 mRNA及蛋白表達的影響 與空白組相比，300 mg/kg組Cyp2d22 mRNA表達降低，150 mg/kg組、300 mg/kg組Cyp2d22蛋白表達均降低(P均<0.05)。見圖4。

2.2 龍井茶多酚提取物不同給藥時長對Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22的影響

2.2.1 對Cyp3a11 mRNA及蛋白表達的影響 Cyp3a11 與對照組相比，7 d組Cyp3a11 mRNA及蛋白表達均降低，28 d組Cyp3a11 mRNA及蛋白表達均增高(P均<0.05)。見圖5。

注：A為Cyp2c37的mRNA相對表達水平,B為Cyp2c37的蛋白相對表達水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖3 不同劑量龍井茶多酚提取物對Cyp2c37 mRNA及蛋白表達的影響

注：A為Cyp2d22的mRNA相對表達水平,B為Cyp2d22的蛋白相對表達水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖4 不同劑量龍井茶多酚提取物對Cyp2d22 mRNA及蛋白表達的影響

2.2.2 對Cyp1a2 mRNA及蛋白表達的影響 Cyp1a2 與對照組相比，7 d組Cyp1a2 mRNA及蛋白表達均增高，28 d組Cyp1a2 蛋白表達增高(P均<0.05)。見圖6。

注：A為Cyp3a11的mRNA相對表達水平,B為Cyp3a11的蛋白相對表達水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖5 龍井茶多酚提取物不同給藥時長對Cyp3a11 mRNA及蛋白表達的影響

注：A為Cyp1a2的mRNA相對表達水平,B為Cyp1a2的蛋白相對表達水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖6 龍井茶多酚提取物不同給藥時長對Cyp1a2 mRNA及蛋白表達的影響

2.2.3 對Cyp2c37 mRNA及蛋白表達的影響 Cyp2c37 與對照組相比，7 d組Cyp2c37 mRNA及蛋白表達均降低(P均<0.05)。見圖7。

2.2.4 對Cyp2d22 mRNA及蛋白表達的影響 Cyp2d22 與對照組相比，7 d組Cyp2d22 mRNA及蛋白表達均降低，14 d組Cyp2d22 蛋白表達增高，28 d組Cyp2d22 mRNA及蛋白表達均增高(P均<0.05)。見圖8。

注：A為Cyp2c37的mRNA相對表達水平,B為Cyp2c37的蛋白相對表達水平;與空白組比較*，P<0.05。

圖7 龍井茶多酚提取物不同給藥時長對Cyp2c37 mRNA及蛋白表達的影響

注：A為Cyp2d22的mRNA相對表達水平,B為Cyp2d22的蛋白相對表達水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖8 龍井茶多酚提取物不同給藥時長對Cyp2d22 mRNA及蛋白表達的影響

3 討論

茶葉是風靡全世界的飲品，尤其受到東方人的喜愛。我國歷來就有“藥茶不能同食”的說法，但始終缺乏全面嚴謹的理論和實驗依據。肝臟是藥物代謝的主要場所，肝藥酶是肝臟中藥物生物轉化或代謝的主要酶系。國內外研究均顯示，Cyp450s變異性較大，易受外源物質的誘導或抑制，從而使自身活性發生改變，導致藥物代謝速度改變，引起藥效減弱以致治療失敗或藥效過強引起毒性[13]。因此，探明茶多酚對Cyp450s的誘導或抑制作用，闡明藥茶不能同食的原理，從而盡可能減少茶葉對藥物代謝的影響，保證臨床藥物濃度維持在安全有效的范圍內有著重要的意義。

杭州西湖龍井是一種著名的綠茶，已有研究表明，與其他不同發酵程度茶葉相比，西湖龍井的綠茶多酚含量較高，其成分以兒茶素為主，主要含有EGCG、EGC、ECG、EC四種，其中尤以EGCG含量最高[1]。目前國內外對綠茶多酚的研究主要集中在其抗氧化及抗腫瘤作用上，但對其影響肝藥酶進而干擾同服底物藥物的代謝作用研究較少。本實驗通過給予小鼠不同劑量和不同服用時間的龍井茶多酚提取物，分別從基因轉錄水平和蛋白表達水平上對龍井茶多酚提取物對小鼠肝Cyp450s四種主要亞型Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2d22和Cyp2c37的作用進行了探討。

本研究結果表明，龍井茶多酚提取物中的主要酚類物質含量最高的是EGCG，占28.8%，其次含量較高的分別有EGC、ECG和C等物質。本研究發現，與空白組相比，150 mg/kg組和300 mg/kg組Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 mRNA及蛋白表達均降低，但150 mg/kg組Cyp1a2 mRNA及蛋白表達均增高，表明150 mg/kg和300 mg/kg龍井茶多酚提取物均能夠顯著抑制小鼠肝Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 mRNA及蛋白表達，上調Cyp1a2的mRNA及蛋白表達，150 mg/kg組龍井茶多酚提取物能顯著性提高Cyp1a2的蛋白表達水平；在時效關系的研究中，隨著給予茶多酚提取物的時間由7 d逐漸延長到28 d，龍井茶多酚提取物對Cyp3a11和Cyp2d22的作用由抑制轉為誘導，對Cyp2c37的抑制作用逐漸消失，但并未表現出誘導作用，而隨著給藥時間的延長龍井茶多酚提取物對Cyp1a2的誘導作用未發生改變。實驗結果提示，龍井茶多酚提取物的攝入量和時間均能影響小鼠肝Cyp450s酶的表達，75 mg/kg龍井茶多酚提取物對該酶四種亞型幾乎無影響，150 mg/kg和300 mg/kg龍井茶多酚提取物對小鼠肝Cyp450s酶呈現顯著誘導或抑制作用，且隨著給藥時間的延長，這種誘導或抑制作用也會發生改變，繼而會加快或減慢與茶葉同服藥物的體內代謝過程，從而使血藥濃度產生波動，不利于藥效的發揮。該實驗結果也為“藥茶不能同食”的傳統說法提供了較為全面的實驗依據。

有研究報道稱低劑量EGCG能夠抑制Cyp3A4的活性，但也有研究報道稱短期的高劑量EGCG對Cyp3A4有顯著的誘導作用[14,15]，但對于茶多酚提取物影響肝藥酶的作用少見系統研究。本課題組前期曾對黃山毛峰茶多酚提取物對肝藥酶的作用進行了研究，結果表明，連續給予7 d 75、150和300 mg/(kg·d)黃山毛峰茶多酚提取物，均能顯著誘導小鼠Cyp3a11 mRNA和蛋白表達[16]。本研究結果則提示，與黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠Cyp3a11的誘導作用不同，龍井茶多酚在連續給予7 d時能夠抑制Cyp3a11的表達，但隨著給予時間延長到28 d，龍井茶多酚和黃山毛峰一樣，顯示出對Cyp3a11的誘導作用，表明茶葉的種類、飲用量、引用時間等均會對肝藥酶產生不同的影響。茶多酚提取物中含多種茶多酚單體成分，這些成分對Cyp450s酶的影響是互相疊加還是互相拮抗，究竟哪一種單體成分起到關鍵的作用，這些問題都有待進一步的深入研究。