Ropalladins類似物對宮頸癌Caski細胞增殖、凋亡的影響

徐歡歡，柯麗娜，黃慧敏，曾小華，朱秀蓮，陳琴華，李斌

1錦州醫科大學國藥東風總醫院研究生培養基地，湖北十堰442008；2湖北醫藥學院附屬東風醫院；3武當特色中藥研究湖北省重點實驗室(湖北醫藥學院)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，化學治療是其治療方法中的重要一種，但化療耐藥性是宮頸癌臨床治療的一大難點，因此研發新的抗腫瘤藥物是目前亟待解決的問題[1～3]。海洋生物堿提取于海洋有機生物，結構新穎，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等多種生物活性，具有良好的藥用前景。以海洋生物堿作為先導化合物，對其進行結構修飾和改造，進而開發出新的抗腫瘤藥物是目前新藥研究的熱點[4,5]。Rhopaladins A-D是從沖繩海洋被膜植物Rhopalaea sp中分離出的四種新的雙吲哚生物堿，研究表明Rhopaladins A-D對與宮頸癌預后相關的癌基因C-erbB-2有顯著的抑制作用[6～9]。本課題組前期合成了[10]Rhopaladins類似物E-N-叔丁基-2-對氯苯甲?；?1-異丙基-4-對氯芐叉基-5吡咯烷酮-2酰胺這一新化合物(簡稱為化合物a)，那么結構類似是否功能也相似呢?2019年8～11月，本研究選用人宮頸癌Caski細胞系作為宮頸癌的體外實驗模型，探討化合物a對宮頸癌Caski細胞的增殖凋亡作用及其可能機制，為后期的抗腫瘤新藥研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人宮頸癌Caski細胞購自中國典型培養物保藏中心。DMSO(MP Biomedicals公司)、RPMI 1640 細胞培養基(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、MTT粉劑(Sigma公司)、TRIzol試劑(Invitrogen公司)、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(聯科生物技術有限公司)、逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)、PCR引物(上海生工生物有限公司合成)、SYBR Green real-time PCR Master Mix(TOYOBO公司)。倒置相差顯微鏡(Olympus 公司)、全波長酶標儀(Bio-Tek公司)、BD-FACS Calibur流式細胞儀、GeneTouchPlus基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)、熒光定量PCR儀(德國耶拿ANALYTIKJENAQTOWER 3G)。

1.2 細胞培養 Caski細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每2～3日傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗研究。

1.3 細胞生長抑制率測定 采用MTT法。選取對數生長期的細胞，以6 000個/孔的密度接種于96孔板中，培養24 h后加藥，設A～H組，A組為不含細胞僅含培養液的空白組，B組為不含藥物的DMSO對照組，C～H組分別為含3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L化合物a的實驗組(DMSO在各組中的含量均<0.1%)，體外培養24、48、72 h后分別加入MTT液20 μL(5 mg/mL)，在細胞培養箱中孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上37 ℃低速振蕩15 min，用全波長酶標儀在490 nm處讀取吸光度值(OD)，并計算細胞生長抑制率=1-(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)。實驗重復3次。根據前期實驗結果，化合物a作用Caski細胞24、48、72 h的IC50分別為39.12、29.21、28.27 μmol/L，故選取后續實驗藥物濃度分別為12.5、25、50 μmol/L(即E、F、G組)，藥物作用時間選擇48 h。

1.4 細胞凋亡率測定 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法。選取對數生長期的Caski細胞接種于6孔板中培養，細胞完全貼壁后設置B組和E、F、G組，分別給予DMSO及終濃度為12.5、25、50 μmol/L的化合物a，培養48 h后收集各組細胞，按試劑盒說明操作，1 h內上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.5 E6、E7 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。分別收集DMSO對照組和E、F、G組作用48 h后的Caski細胞，TRIzol法提取細胞中的總RNA后測定RNA濃度，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。采用real-time PCR法檢測不同濃度的化合物a作用于Caski細胞48 h后對E6、E7 mRNA表達的影響。在qTower 3G PCR儀上進行PCR反應，Caski E6 mRNA引物序列：上游5′-TTGCTTTTCGGGATTTATGC-3′，下游5′-CAGGACACAGTGGCTTTTGA-3′，產物長度為204 bp。Caski E7 mRNA引物序列：上游5′-GAACCGGACAGAGCCCATTA-3′，下游5′-AGAACAGATGGGGCACACAAT-3′，產物長度為150 bp。內參GAPDH mRNA引物序列：上游5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′，下游5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，產物長度為251 bp。引物均委托上海生工公司合成。PCR反應體系：SYBR Green real-time PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，加水至20 μL。Caski E6mRNA的PCR擴增程序為：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環；Caski E7 mRNA的PCR擴增程序為：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環；每個樣本設3個復孔，實驗重復3次。采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量[11]。

2 結果

2.1 不同濃度、不同時間化合物a干預后Caski細胞的生長抑制率變化 作用24、48、72 h后，與B組相比，C～H組生長抑制率均增高(P均<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度、不同時間化合物a干預后Caski細胞的生長抑制率變化

2.2 各組細胞凋亡率比較 B、E、F、G組細胞凋亡率分別為8.74%±0.77%、12.38%±0.72%、24.98%±1.34%和39.83%±1.66%，E、F、G組細胞凋亡率均高于B組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 各組流式細胞術結果

2.3 各組E6、E7 mRNA表達比較 B、E、F、G組E6 mRNA表達量分別為1.010±0.207、0.667±0.081、0.575±0.123、0.345±0.060，E7 mRNA表達量分別為1.020±0.255、0.495±0.133、0.479±0.172、0.423±0.109，E、F、G組E6、E7 mRNA表達均低于B組(P均<0.05)。見圖3。

注：與B組比較，*P<0.05；**P<0.01。

圖3 各組E6、E7 mRNA表達比較

3 討論

宮頸癌的發病率和病死率在全球均占第四位，2018年全球有57萬例新增宮頸癌病例，31.1萬死亡病例，在全球女性癌癥發病和死亡病例中分別占6.6%和7.5%[12]。研究表明，宮頸癌的發生與高危型(HR)HPV感染密切相關[13]。HR HPV共有15種，其中HPV16型是最常見的HR HPV之一，故本課題選擇HPV16陽性細胞Caski作為研究對象。HPV是一種嗜上皮的雙鏈環狀DNA病毒，其編碼的E6、E7基因被認為是致癌基因[14]。機體感染HPV后，E6/E7基因整合到宿主染色體后表達致癌蛋白E6/E7，其與p53和pRb蛋白結合，導致細胞增殖失控，最終引發癌癥[15]。E6/E7基因還可靶向調控其他癌癥相關途徑蛋白，最終促進細胞分裂增殖[16]。研究表明，E6基因還可結合死亡受體，從而阻斷細胞凋亡[15]。此外，E6/E7基因還可上調某些致癌性miRNA水平、降低抑癌性miRNA水平[17]，抑制干擾素的信號傳導途徑，使病毒逃避免疫系統[16]。以上研究表明E6/E7基因是宮頸癌治療的重要分子靶點。

海洋生物堿具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種生物活性，是新藥研發的重要來源，但海洋生物堿采集困難，且提取產率較低，嚴重阻礙了其開發及研究。通過化學合成法對海洋生物堿類化合物進行結構修飾和改造,成為解決這一問題的有效手段[18]。本研究合成了海洋生物堿Rhopaladins類似物——化合物a，并考察其對宮頸癌Caski細胞的作用及可能機制。本研究發現，與B組相比，E、F、G組生長抑制率、細胞凋亡率均增高，表明化合物a對宮頸癌Caski細胞體外增殖具有顯著的抑制作用，可誘導并促進Caski細胞的凋亡；E、F、G組E6、E7 mRNA表達均低于B組，提示化合物a抑制Caski細胞增殖并促進其凋亡的機制可能與降低E6、E7 mRNA的表達有關。

綜上所述，化合物a具有抑制Caski細胞增殖并促進其凋亡的作用，其機制可能與下調E6、E7 mRNA的表達有關，但其具體機制有待進一步深入研究。