miR-125b對人心肌細胞HCM的保護作用及機制

解小霞，孫曉靜，蘇文煬 ，楊柳，李力，王薇，李婷，田永強

1武漢市中醫醫院，武漢430014；2湖北省中醫院

急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的冠狀動脈疾病之一，可導致冠狀動脈供血減少、機體組織缺氧等癥狀，嚴重者在數分鐘內發生心臟停搏[1]。心肌細胞凋亡、心室重構、心肌纖維化等均是心肌梗死后心肌細胞病變代償的重要病理生理過程[2]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA序列，通過與靶基因特異性結合抑制靶基因表達。研究顯示，人體內約有半數以上的基因受miRNA的直接或間接調控，miRNA的異常表達與多種疾病的發生、發展密切相關[3]。在AMI進展過程中存在miRNA的異常表達譜，特異性表達的miRNA可作為AMI早期診斷的分子標記物[4]。2017年8月～2018年12月，本研究通過觀察AMI患者血漿miR-125b的表達量，以及miR-125b對人心肌細胞HCM凋亡與增殖活力的影響，以炎癥、免疫系統平衡為切入點，探討miR-125b對人心肌細胞的保護作用，為AMI的防治提供有效治療策略。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年8月～2018年12月在我院心內科診治的AMI患者68例為AMI組。納入標準：年齡30～75歲；符合AMI的相關診斷；肌鈣蛋白I(cTnI)水平>0.1 ng/mL或肌酸肌酶同工酶(CK-MB)水平升高1倍；心電圖ST段抬高或壓低以及新發生存活心肌的丟失或者節段性室壁運動異常的影像學證據；心電圖上出現病理性Q波，胸痛持續時間大于20 min。排除標準：心律失常、心力衰竭等心臟疾病、惡性腫瘤及其他免疫系統疾病等，另收集體檢健康對照者50例作為正常對照組，排除心血管疾病、惡性腫瘤以及其他免疫系統疾病。所有受試者均簽署患者知情同意書并通過倫理審查。

1.2 細胞與試劑 人心肌細胞HCM細胞購于中科院上海細胞庫。Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司，real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，TRIzol試劑來自美國Thermo Fisher Scientific公司，RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物科技有限公司，MTT試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司，青霉素、鏈霉素購自Gibco BRL公司，熒光素酶檢測試劑購自Promega北京生物技術有限公司，熒光素酶報告載體由Promega公司合成，Annexin V/PI檢測試劑盒購自上海碧云天公司。流式細胞儀購自美國BD公司。miR-125b模擬物序列為5′-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3′，miR-125b引物序列為:5′-CTGGTCCTAGTCAAATACCCCA-3′，3′-ACGCAAATTCGTGAACGTT-5′。miR-125b mimics購自上海吉瑪生物制藥有限公司。GAPDH、炎性小體(NLRP3)、白細胞介素1β(IL-1β)、趨化因子2(CCL2)、趨化因子C-X3-C-配體1(CX3CL1)、補體應答基因-32(RGC32)兔抗人的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.3 血清miR-125b表達檢測 空腹采集所有研究對象的靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清1 mL。采用TRIzol一步法提取總RNA并純化，逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR法檢測miR-125b表達情況。引物序列：miR-125b-F為5′-CTGGTCCTAGTCAAATACCCCA-3′，miR-125b-R為5′-ACGCAAATTCGTGAACGTT-3′；U6-F為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-R為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應參數：90～95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，PCR反應進行30個循環，72℃延伸10 min，反應體系為20 μL，以U6為內參，所得數據采用2-ΔΔCt法進行表達量相對定量分析。

1.4 細胞增殖活力檢測 采用CCK-8法測定HCM細胞相對增殖率的影響。取對數生長期HCM細胞，加入DMEM培養基，調整細胞密度為1×105/mL，接種于96孔板中，吸棄細胞培養基，加入PBS輕洗細胞2次，分別采用瞬時轉染法將miR-125b mimics(濃度分別為200、100、50 nmol/L)及NC mimics(濃度分別為200、100、50 nmol/L)轉染入HCM細胞，轉染8 h后去除轉染液，加入1 mL的OPTI-MEM培養基繼續培養24 h及48 h。在熒光顯微鏡下觀察示，轉染效率達90%以上，表明轉染條件可靠。加入配好的含10%CCK-8試劑的培養基，同時設置空白對照。37 ℃孵育1 h，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標儀上以試驗波長為570 nm，參比波長為450 nm測定光密度值。細胞相對增殖率(%)=[(B-A)/B×100%]，A為miR-125b mimics或NC mimics轉染組OD值，B為空白組OD值。每個實驗重復3次，每次測量3次。

1.5 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。將密度為1×105個/mL的HCM細胞接種于12孔板，吸棄細胞培養基，加入PBS輕洗細胞3次，除空白組外，2 h后吸去培養基，按上述miRNA mimics瞬時轉染步驟進行瞬時轉染，使miR-125b mimics終濃度分別為50、100 nmol/L，轉染NC mimics終濃度為100 nmol/L，另設空白組，轉染后于37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續培養24 h。加入胰酶消化細胞，PBS洗3次，分別加入5 μL FITC-annexin V和2 μL PI，常溫下避光孵育10 min，補齊總體積至500 μL，4 ℃冰浴避光放置。過濾后在流式細胞儀上測定細胞早期凋亡的百分比。

1.6 細胞免疫、炎癥相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測細胞免疫、NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32表達。按上述miRNA mimics瞬時轉染步驟進行瞬時轉染，使miR-125b mimics終濃度為200 nmol/L，另設NC mimics組(終濃度為100 nmol/L)、空白組，取對數生長期各組細胞，胰酶消化后加入細胞裂解液(RIPA)50 μL裂解細胞提取總蛋白，采用Bradford方法進行蛋白定量。采用SDS-PAGE電泳分離總蛋白，每道孔上樣50 μg總蛋白質，電泳2 h后，采用濕法轉膜至PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000稀釋)過夜，次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，ECL顯影，保存圖像，以β-actin為對照，采用Quantity One側光密度值。實驗重復3次。

1.7 miR-125b靶基因進行預測 采用熒光素酶實驗。利用Targetscan、miRanda數據庫對miR-125b靶基因進行預測，結果發現NLRP3與miR-125b存在9個連續的堿基互補配對。為檢測miR-125b是否能夠識別NLRP3-3′UTR區域，構建包含NLRP3 3′UTR(wt)區域以及熒光素酶報告基因的質粒，將質粒與100 nmol/L miR-125b mimics或100 nmol/L NC mimics共同轉染入HCM細胞，使用雙熒光素酶報告基因測定試劑盒，轉染48 h后進行螢光素酶測定，實驗重復3次。

2 結果

2.1 AMI組與正常對照組患者血清miR-125b水平比較 AMI組、正常對照組血清miR-125b水平分別為0.26±0.05、1.02±0.08，AMI組血清miR-125b表達水平低于正常對照組(P<0.01)。

2.2 不同時間、轉染不同濃度NC mimics、miR-125b mimics的細胞增殖情況比較 24、48 h時，轉染各濃度miR-125b的HCM細胞相對增殖率均高于轉染NC mimics后(P均<0.05)。見表1。

表1 轉染不同濃度miR-125b mimics、NC mimics細胞的增殖情況比較

注：與NC mimics比較，△P<0.01，*P<0.05。

2.3 轉染NC mimics、miR-125b mimics的細胞早期凋亡情況比較 空白組、轉染NC mimics終濃度100 nmol/L、miR-125b mimics終濃度50 nmol/L、miR-125b mimics終濃度100 nmol/L細胞的凋亡百分比分別為12.98%±1.42%、11.56%±1.27%、2.06%±0.33%、3.10%±0.23%，轉染50、100 nmol/L miR-125b mimics后HCM細胞的早期凋亡百分比均低于轉染NC mimics后(P<0.05或0.01)。見圖1。

2.4 轉染miR-125b后NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白表達比較 轉染miR-125b mimics 200 nmol/L后HCM細胞內NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32的表達量均較NC mimics組降低(P<0.05)，見表2、圖2。

2.5 雙熒光素酶報告分析結果 相比于NC mimics組，pMIRREPORTER -NLRP3WT-luc和 miR-125b mimics共轉染明顯降低NLRP3的3′UTR區熒光酶活性(P<0.01)，而pMIR-REPORTER-NLRP3 MUT-luc和miR-125b mimics及NC mimics組共轉染均無此作用。結果表明，miR-125b mimics通過直接靶向作用于NLRP3的3′UTR區域，抑制HCM細胞中NLRP3的表達，見圖3。

3 討論

miRNA是一類長20～24個核苷酸的非編碼小RNA分子，在動植物中廣泛存在，通過特異性作用于靶基因，導致靶基因沉默或降解，參與機體內多種病理、生理過程[5]。2008年，科學家在人血漿和血清中檢測到miRNA的存在，并且發現血循環miRNA可通過血液運送到相關靶器官，調節靶基因的表達而影響機體的生物學、病理學功能[6]。目前，血循環miRNA在冠狀動脈粥樣硬化及心肌細胞保護等方面的作用開始成為學者重點關注的方向[7]。

注：A為空白組，B為轉染NC mimics 100 nmol/L，C為轉染miR-125b mimics 100 nmol/L，D為轉染miR-125b mimics 50 nmol/L。

圖1 轉染NC mimics、miR-125b mimics的細胞凋亡情況(流式細胞術)

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01。

圖2 轉染miR-125b后NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白表達情況(Western blotting法)

注：與NC mimics組相比，**P<0.01。

圖3 雙熒光素酶活性檢測

2009年，研究人員首次在大鼠AMI模型中發現miR-206顯著高表達，并與AMI進展存在一定的相關性[8]。研究發現，miRNA對AMI大鼠有正面調節作用，其中miR-98、miR-29、miR-1可有效增強心肌纖維化的收縮力[9]。急性非ST段抬高性心肌梗死(NSTEMI)患者血漿miR-1、miR-21、miR-423-5p、miR-133a表達量均上升3～5倍，提示miRNA表達譜與AMI疾病進展具有潛在的相關性[10]。同期，研究人員從相關文獻中檢索出119種AMI特異性miRNA，通過Targetscan靶點及GO功能分析，表明這些miRNA參與心血管疾病的發病過程，其中，miR-106b和miR-15b可分別作為AMI中血管凋亡和再生的調節因子[11]。生物信息分析人員通過二代測序技術分析了50例AMI患者的miRNA差異表達譜，結果發現miR-146a、miR-150、miR-155在AMI患者體內存在差異表達，其中miR-146a 50%在人心臟中表達，表明miRNA在不同組織中表達存在顯著差異性[12]。

研究表明，miR-125b在心臟組織中表達較為豐富，與心肌細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程密切相關[13]。miR-125b表達水平與心肌缺血心臟恢復能力呈正相關關系，缺血后適應處理后miR-125b水平均不同程度增高，提示miR-125b可能參與心肌缺血恢復過程[14]。同時，miR-125b在AMI患者血清表達豐度均不同程度下降，并且在AMI動物模型中也得到了證實，提示miR-125b可能與AMI的發病進展密切相關[15]。本研究結果顯示，相對于健康對照組，miR-125b在AMI組患者血清中表達水平顯著降低，提示miR-125b可能與AMI后心肌細胞的功能保護與恢復相關；轉染各濃度miR-125b的HCM細胞的相對增殖率均高于轉染NC mimics后，表明轉染miRNA-125b可促進HCM細胞的增殖，抑制HCM細胞凋亡，從而起到心肌細胞保護作用。

現代醫學表明，動脈粥樣硬化、脂類代謝紊亂、免疫功能失衡是導致AMI的主要因素，相關免疫細胞的分化與增殖可調控AMI疾病的進展[16]。作為模式識別受體家族的重要組成部分，NLRP3炎癥小體在天然免疫系統中發揮著重要作用，與AMI的發生、發展密切相關。NLRP3炎癥小體的活化可導致機體炎癥反應激活與起始，炎癥性的Ly-6Chigh單核細胞是AMI最早反應的免疫細胞，心肌缺血受損后特異性表達趨化因子CX3CL1、CCL2，進而促進單核細胞分泌VEGF和TGF-β，加速心肌HCM細胞修復[17]。VEGF、TGF-β、皮質激素、黃體生成素同時誘導免疫調節因子補體應答基因RGC32的表達，后者廣泛參與腫瘤增殖、分化、炎癥、轉移等多種生物學過程。研究顯示，RGC32在心臟缺血后心肌重塑過程表達顯著上調，但目前關于RGC32對心肌梗死心肌細胞的影響及機制尚不清楚[18]。本研究發現，轉染miR-125b mimics后HCM細胞內NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32的表達量較轉染NC mimics后明顯降低，表明miR-125b可抑制HCM細胞中免疫、炎癥調節因子的激活，減輕心肌炎癥性損傷。

綜上所述，AMI患者血清miRNA-125b表達量顯著降低，同時miRNA-125b可促進HCM細胞的增殖，同時可抑制HCM細胞凋亡，雙熒光素酶實驗驗證了miR-125b 可直接靶向作用于NLRP3，并且miR-125b可顯著抑制HCM細胞中免疫、炎癥調節因子NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白的表達，從而抑制NLRP3/IL-1β通路激活，從而起到保護心肌細胞的作用。