非小細胞肺癌組織中上皮鈣黏著蛋白、黏蛋白1、PINCH mRNA的表達變化及其臨床意義

王艷,鄭末,王碩瑩,馬麗,曾妮,黃少祥

天津市第五中心醫院,天津 300450

全球肺癌的死亡率和發生率均居癌癥之首[1]，非小細胞肺癌占肺癌的80%左右，其治療方法主要以手術治療和化療為主，隨著靶向治療的逐漸發展，非小細胞肺癌患者的預后得到極大改善[2]，但是其生存率依然偏低，因此探索非小細胞肺癌發生及發展的作用機制具有重要的臨床意義[3]。隨著腫瘤分子生物學研究的深入，近年發現腫瘤的發生發展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關。上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin)屬于鈣黏著素超家族成員，介導細胞間的黏著和相互作用，參與腫瘤的侵襲和轉移[4,5]。黏蛋白1(MUC1)屬于黏蛋白家族成員，是一種高糖基化的跨膜蛋白，在腫瘤組織中表達異常，主要發揮促進腫瘤細胞的增殖、耐藥和轉移的作用[6,7]。半胱氨酸-組氨酸富裕蛋白(PINCH)屬于黏著斑蛋白家族成員，富含半胱氨酸和組氨酸的氨基酸區域能夠形成鋅指結構域，介導細胞外基質與細胞之間黏附和細胞信號轉導，與腫瘤的轉移、增殖和凋亡抑制聯系密切[8]。E-cadherin、MUC1及PINCH均為黏附分子家族成員，介導細胞間和細胞基質間相互作用，參與細胞的黏附和遷移等功能，在多種腫瘤中，三者均參與腫瘤的發生發展，影響腫瘤細胞的局部浸潤和遠處轉移[9]。目前E-cadherin、MUC1及PINCH在非小細胞肺癌中的表達變化及其是否參與了肺癌發生發展過程尚不明確。本研究觀察了非小細胞肺癌組織中E-cadherin、MUC1和PINCH的表達變化情況，并分析了癌組織中E-cadherin、MUC1和PINCH的表達與患者臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年5月～2019年2月在天津市第五中心醫院接受手術治療的非小細胞肺癌患者77例，男40例、女37例，年齡39～72(52.18±9.78)歲。既往有吸煙史19例。肺腺癌47例、肺鱗癌30例。根據肺癌TNM分期標準(第八版)：Ⅰ期35例、Ⅱ期18例、Ⅲ期15例、Ⅳ期9例。根據腫瘤細胞的分化程度：低分化51例、中分化17例、高分化9例。淋巴結轉移22例。肺癌直徑≤5 cm 48例，>5 cm 29例。納入標準：①經病理學診斷確診為非小細胞肺癌；②臨床資料完整；③初次診斷為非小細胞肺癌，并且在入院之前未接受過放化療治療。排除標準：①肝腎功能異常；②確診為肺癌，但是合并有其他類型腫瘤；③孕婦或者處于哺乳期；④存在精神障礙，對治療的依從性較差；⑤非小細胞肺癌復發患者；⑥無法進行手術患者。臨床研究開展前均與患者取得聯系，并與其簽署知情同意書。臨床研究的開展經過院倫理委員會的批準。

1.2 受檢組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的檢測 采用實時熒光定量PCR法。術中切除非小細胞肺癌患者的肺癌組織，同時切除距離肺癌組織邊緣5 cm以上的正常組織作為對應的癌旁組織。術中切除組織后立即將組織放置到凍存管中，投入到液氮中快速冷凍，并在液氮中長期保存。待所有入組患者的臨床樣本采集完全后，將所有腫瘤組織及其癌旁組織樣本從液氮中取出，根據臨床組織樣本的重量加入足量的TRIzol溶液、按說明書步驟提取受檢組織總RNA。通過逆轉錄法對提取的RNA進行逆轉錄反應，制備相應的cDNA。然后以β-actin作為內參，通過熒光定量PCR法檢測E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA，實驗操作嚴格按照熒光定量PCR儀(鄭州南北儀器設備有限公司，型號：TL988-IV)的操作流程進行。用2-ΔCt表示受檢組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct目標蛋白-Ctβ-ACTIN。E-cadherin的PCR引物：正向引物：5′-AAGCCTCAGGTCATAAACATC-3′，反向引物：5′-CGCCTCCTTCTTCATCATAG-3′。MUC1的PCR引物：正向引物：5′-GGTTCAAGTTACCGAAGGC-3′，反向引物：5′-GCAAGGAACACTTCGTTCG-3′。PINCH的PCR引物:正向引物：5′-AACATCGGCCGGTCCGGTAT-3′，反向引物：5′-TTGGCGGCACCAATTCGGC-3′。β-actin的PCR引物:正向引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物：5′-CAGGAGGTAGGTTCATAG-3′。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌組織及癌旁正常組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA相對表達量比較 非小細胞肺癌癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量分別為1.33±0.27、7.67±1.25、11.33±2.61，癌旁組織中分別為10.33±2.38、0.71±0.15、2.56±0.58，與癌旁正常組織比較，非小細胞癌組織中E-cadherin mRNA相對表達量低，MUC1 mRNA、PINCH mRNA相對表達量高(P均<0.05)。

2.2 非小細胞肺癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量與患者臨床病理參數的關系 非小細胞肺癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量與TNM分期和淋巴結轉移相關(P均<0.05)，與患者的年齡、性別、病理類型、分化程度、吸煙史和腫瘤大小無關(P均>0.05)，詳見表1。

表1 非小細胞肺癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量與患者臨床病理參數的關系

2.3 非小細胞肺癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA表達的相關性 非小細胞肺癌中E-cadherin mRNA與MUC1 mRNA表達呈負相關(r=-0.635，P<0.001)；E-cadherin mRNA與PINCH mRNA表達呈負相關(r=-0.708，P<0.001)；MUC1 mRNA與PINCH mRNA表達無相關性(r=0.172，P=0.098)。

3 討論

鈣黏蛋白是細胞黏附分子，分為E、P和N三種類型，E-cadherin基因位于第16號染色體的16q22-q23.1位點，主要分布在上皮細胞表面，介導細胞間及細胞和基質間黏附。研究表明，肺癌[10]、乳腺癌[11]等惡性腫瘤細胞表面E-cadherin表達減少，并且是腫瘤細胞惡性間質性表型的標志分子，與腫瘤細胞的侵襲和轉移能力密切相關。本研究中，癌組織中E-cadherin表達明顯低于癌旁組織，其機制可能是腫瘤細胞絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活促進腫瘤細胞的上皮間質轉化的關鍵轉錄因子Snail1表達增加，Snail1結合并抑制E-cadherin的表達，導致E-cadherin水平降低[12]。此外，本研究發現非小細胞肺癌組織中E-cadherin表達與非小細胞肺癌TNM分期及淋巴結轉移有關，表明E-cadherin的表達可能參與非小細胞肺癌的發生發展和轉移。其主要原因一方面是非小細胞肺癌細胞中E-cadherin表達量下調會導致腫瘤細胞之間的黏著性下降，癌細胞更傾向于向病灶外的區域發生轉移，導致分期升高且易出現淋巴轉移。另一方面，腫瘤細胞E-cadherin表達量下調常導致腫瘤細胞發生上皮間質轉化，促進腫瘤細胞的惡性增殖，導致腫瘤分期升高[13]。

黏蛋白是一種高分子量的糖蛋白，具有潤滑和保護上皮細胞的的作用，分為膜結合型蛋白和分泌型黏蛋白，MUC1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，其基因定位于1q21，翻譯后被分解為氮端和碳端，兩者通過非共價鍵形成異源二聚體，機體處于正常狀態下，MUC1表達水平較低，多分布在胃腸道、呼吸道、乳腺等分泌上皮細胞的近管腔面[14,15]。近年研究表明腫瘤細胞中MUC1氮端通過與細胞間黏附分子-1、E-選擇素、半乳凝素-3結合激活相關的信號通路，從而促進腫瘤細胞的增殖、轉移的發生。本研究發現非小細胞肺癌組織中MUC1表達量明顯升高，其機制可能是腫瘤微環境中表皮生長因子受體家族、酪氨酸激酶受體活化后，激活PI3K/AKT信號通路、NF-κB 信號通路等，促進腫瘤細胞MUC1 的表達[16]。本研究中MUC1表達與非小細胞肺癌的TNM分期及淋巴結轉移有關。其原因可能是由于MUC1與腫瘤干細胞的形成密切相關，MUC1的表達量增加會導致非小細胞肺癌細胞中干細胞比例增加，從而有利于非小細胞肺癌細胞的增殖，同時腫瘤干細胞具有很強的遷移能力，因此MUC1表達下調能夠有效增強腫瘤細胞的轉移能力，導致非小細胞肺癌惡性程度加重和轉移的增加[17]。

PINCH作為一種傳導整合蛋白，通過雙鋅指結構域與相應配體結合，參與細胞的黏附和遷移功能，主要在細胞質和基質中低水平表達。目前已經證實PINCH在乳腺癌、肺癌、大腸癌及前列腺癌等多種腫瘤中表達水平異常升高[18]，PINCH作為MAPK和TGF-β通路的下游分子，通過相應下游效應因子促進腫瘤的增殖和轉移。本研究中，非小細胞肺癌組織中PINCH表達量明顯升高，其原因可能與腫瘤細胞中Rsu1表達降低后，促進PINCH表達有關，其機制是Rsu1的表達具有穩定PINCH的作用，Rsu1表達降低導致PINCH蛋白降解增多[19]。此外，癌組織中PINCH表達與TNM分期及淋巴結轉移密切相關，提示PINCH參與非小細胞肺癌的發生及發展過程。其機制是非小細胞肺癌中PINCH表達下調能夠激活MAPK和TGF-β信號通路，從而促進非小細胞肺癌細胞的增殖，同時PINCH與Nck-2 結合后，磷酸化激活蛋白激酶B，與整合素連接激酶氮端的錨蛋白集合形成的復合物影響整合素信號通路，參與細胞的轉移[20]。

本研究中E-cadherin表達與MUC1及PINCH表達呈負相關，其原因可能是PINCH的LIM1域與整合素連接激酶相互作用，從而通過特定的整合素/整合素連接激酶信號通路介導局灶性粘連，進而影響E-cadherin表達水平[21]。腫瘤微環境中TNF-α和IFN-γ能夠促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，導致NF-κB通路的活化，抑制E-cadherin表達同時，促進MUC1表達[22]。

綜上所述，在非小細胞肺癌組織中E-cadherin mRNA表達下調，而MUC1 mRNA和PINCH mRNA表達上調，E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA和PINCH mRNA表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關。E-cadherin、MUC1和PINCH有可能共同參與調控非小細胞肺癌的增殖及轉移等惡性生物學行為，有望成為非小細胞肺癌診斷、療效評估及預后預測的分子標記物。