羅格列酮病灶區灌注對腦出血家兔繼發腦損傷的預防作用觀察及機制探討

李軍，葉飛，王麗琨，任思穎，伍國鋒

貴州醫科大學附屬醫院，貴陽550004

腦出血是指非外傷性腦實質血管破裂出血，腦出血后對腦組織的損害機制主要包括血腫的機械占位效應和繼發性損害，繼發性腦損害是目前腦出血研究的熱點[1, 2]。繼發性損害涉及血腫局部的炎癥反應[3]、血紅蛋白[4]、凝血酶[5]等多種作用機制，繼發性腦損害可導致病灶周圍腦組織水腫的加重，腦組織水腫的嚴重程度可以反映繼發性損害的嚴重程度[1]。水通道蛋白(AQP)-4是中樞神經系統介導水分子跨膜轉運水通道的主要亞型，在維持血腦屏障完整性及通透性上起重要作用，且在缺血缺氧性腦病、腦外傷等腦損傷后腦水腫的病理生理過程中發揮重要作用。羅格列酮是噻唑烷二酮類藥物，是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動劑。我們課題組前期研究結果表明羅格列酮顱內病灶周圍灌注可以減輕腦出血后繼發性損害[6]，改善預后[7],但其具體機制尚不明確。2016年4月～2018年1月，本研究中，我們建立了腦出血家兔模型，觀察了羅格列酮病灶區灌注后腦出血家兔病灶周圍腦組織血腦屏障通透性、腦水腫及神經功能損害情況，并觀察了病灶周圍腦組織AQP-4的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 健康新西蘭大耳白兔45只，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，體質量2.8～3.4 kg，雌雄不分，動物均在光照充足，溫度在10 ℃～30 ℃的動物中心室內由動物中心專門人員按照清潔級家兔要求飼養。本課題獲得貴州醫科大學倫理委員會批準后開展相關動物實驗。AQP-4單克隆抗體(武漢博士德公司)，AQP-4二抗(中山公司)，DAB顯色試劑盒(中山公司)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。ZH-藍星B型兔腦立體定位儀(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)，MIR-153干燥箱(日本三洋公司)，SynergyH4酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)，全自動聚焦生物顯微鏡N-800D(蘇州南光電子科技有限公司)。

1.2 腦出血家兔模型制作及羅格列酮病灶區灌注方法 45只健康家兔隨機分為對照組、模型組及羅格列酮組，各15只。每組家兔均在模型制備前禁食禁飲。耳緣靜脈麻醉后，固定在立體定位儀上，沿著頭頂正中線切開頭皮，長度約2 cm,分離皮下筋膜至顱骨，充分暴露“十”字縫和“人”字縫。取“十”形交叉點為0點，調整立體定位儀穿刺針頭至0點左側6 mm(AP0/L6)為穿刺點，深度約12 mm為靶點，即基底節中心點，用穿刺針頭垂直鉆破顱骨。①對照組：采用7號針頭沿顱骨針道垂直刺入，深度12 mm，以500 μL/min以下速度均勻緩慢注入生理鹽水0.3 mL，留針10 min后緩慢拔出，6 h后再次連接7號針頭，以500 μL/min以下速度均勻緩慢注入生理鹽水0.1 mL，留針10 min后緩慢拔出。②模型組：家兔耳中央動脈采集自體動脈血0.8 mL,立即連接7號針頭沿顱骨針道垂直刺入,深度12 mm，以500 μL/min以下速度均勻緩慢注血0.3 mL，其余0.5 mL丟棄，留針10 min后緩慢拔出，6 h后再次連接7號針頭以500 μL/min以下速度均勻緩慢注入生理鹽水0.1 mL，留針10 min后緩慢拔出。③羅格列酮組：在模型組處理的基礎上，6 h后更換7號針頭以500 μL/min以下速度均勻緩慢注入含有羅格列酮0.2 mg/kg生理鹽水0.1 mL，留針10 min后緩慢拔出。各組均在模型制備完成后，徹底消毒，局部包扎，40萬U青霉素肌肉注射預防感染。分別在上述處理后的第1天、3天和7天評估三組神經功能，然后將2%伊文思藍(2 mL/kg)經耳緣靜脈注入。使用3%戊巴比妥鈉經耳緣靜脈注射麻醉，灌洗后斷頭取腦，將針道中心直徑1.5 cm以外的腦組織切除，四分法將腦組織均勻分成4塊，一份立即蘸干后秤取濕重后盡快烘干測量腦組織含水量，一份加入配制好的甲酰胺溶液中待測伊文思藍含量，一份立即放入多聚甲醛溶液中固定用于HE染色及免疫組化法檢測AQP-4的表達，最后一份可-80 ℃冰箱保存備用或做其他檢測。

1.3 各組神經功能、腦組織含水量、血腦屏障通透性檢測 采用Purdy評分評估神經功能。采用干濕重法檢測腦組織含水量,腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。血腦屏障通透性：通過腦組織伊文思藍含量評定，伊文思藍越高表明腦組織血腦屏障通透性越高。腦組織伊文思藍含量測定方法如下，先制作標準曲線后精確稱取腦組織濕重，3次取平均值并記錄。利用標準曲線線性回歸方程y=0.005 3x+0.060 8(R=0.989 9)計算出樣本的伊文思藍含量(B值)，腦組織伊文思藍含量=B×甲酰胺容積(mL)/濕重(g)。

1.4 病灶周圍腦組織神經細胞、神經膠質細胞形態觀察 采用HE染色法。將標本放入蘇木素6 min.然后入1%鹽酸乙醇10 s，伊紅1 min，再依次入70%乙醇1.5 min、80%乙醇2 min、90%乙醇2 min、95%乙醇2 min、100%乙醇4 min、100%乙醇5 min，最后二甲苯透明2次、每次5 min，中性樹膠封片。在400 倍鏡下觀察腦組織中神經細胞和膠質細胞形態。

1.5 腦組織AQP-4的檢測 采用免疫組織化學法。將腦組織泡入4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切片，PBS沖洗以及抗原修復。以小鼠AQP-4作為一抗，山羊抗兔或鼠IgG抗體為二抗，先后加入一抗、二抗后DAB染色液顯色，蘇木素復染，沖洗，梯度乙醇脫水，松節油透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。PBS作陰性對照。光鏡下觀察5個不同視野，計算AQP-4陽性表達的平均光密度值。

2 結果

共使用家兔48只，其中各有1只在制作模型過程中和制作模型后意外死亡，1只在處死后發現顱內感染，45只按實驗設計成功制備模型。

2.1 各組不同時間Purdy評分、腦組織含水量、血腦屏障通透性比較 與對照組比較，模型組灌注后第3、7天Purdy評分均升高、病灶周圍腦組織含水量增加，且灌注后第3天達高峰，各時間點腦組織伊文思藍含量均高(P均<0.05)；與模型組比較，灌注后第3、7天羅格列酮組Purdy評分均低、病灶周圍腦組織含水量減少，各時點腦組織伊文思藍含量均低(P均<0.05)，見表1。

2.2 各組不同時間病灶周圍腦組織神經細胞、神經膠質細胞形態觀察 對照組灌注后第1、3、7天病灶周圍腦組織中神經細胞和膠質細胞形態正常。模型組灌注后第1天病灶周圍腦組織中有明顯出血灶，病灶周圍組織水腫明顯，伴有大量炎細胞浸潤，神經細胞、膠質細胞腫脹，細胞周圍間隙變大，細胞深染或固縮；模型組灌注后第3天病灶周圍腦組織可見組織水腫和細胞間隙空泡化最為明顯，炎細胞浸潤，部分神經細胞壞死、消失；模型組第7天病灶周圍腦組織可見炎癥細胞數增加，可見病灶周圍及血腫內膠質細胞增生，水腫帶逐漸消退，膠質細胞增生明顯。與同一時間點的模型組比較，羅格列酮組灌注后第1、3、7天腦組織病灶周圍組織水腫范圍減小，程度減輕，腫脹細胞較少，神經固縮細胞較少，細胞周圍間隙變小，并可見較多增生膠質細胞，見圖1。

表1 各組不同時間點Purdy評分、腦組織含水量、腦組織伊文思蘭含量

注：a、b、c分別為對照組第1、3、7天神經細胞、神經膠質細胞；d、e、f分別為模型組第1、3、7天神經細胞、神經膠質細胞；g、h、i分別為羅格列酮組第1、3、7天神經細胞、神經膠質細胞。正常形態神經細胞和膠質細胞形態正常(★箭頭)，出血灶(▲箭頭)，組織水腫空泡變性(◆箭頭)，炎細胞浸潤(●箭頭)，細胞深染或固縮(■箭頭)。

圖1 各組家兔不同時間病灶周圍腦組織神經細胞、神經膠質細胞形態(×400)

2.3 各組不同時間病灶周圍腦組織AQP-4表達比較 灌注后第1、3、7天，羅格列酮組AQP-4表達量分別為0.207±0.006、0.236±0.007、0.157±0.007，模型組分別為0.228±0.063、0.285±0.008、0.198±0.004；對照組分別為0.125±0.100、0.118±0.009、0.119±0.005；各時間點，與對照組比較，模型組AQP-4表達量升高；與模型組比較，羅格列酮組AQP-4表達量降低(P均<0.05)。

2.4 腦出血家兔病灶周圍腦組織AQP-4表達與腦組織含水量、腦組織伊文思蘭含量及Purdy評分相關性 病灶周圍腦組織AQP-4表達水平與腦組織含水量(r=0.82，P<0.01)、腦組織伊文思蘭含量(r=0.93，P<0.01)及Purdy評分(r=0.94，P<0.01)均呈顯著正相關。

3 討論

PPARγ是位于細胞核膜上的轉錄因子，當其被激活后與視黃酸受體(RXR)形成異源二聚體調控目的基因的轉錄[8]。PPARγ激活后可以通過多種途徑減輕腦出血后繼發性損害。大量的動物實驗研究表明，PPARγ激動劑噻唑烷二酮類藥物在減輕腦出血后繼發性損害，改善預后上有良好的效果[8,9]。本研究結果顯示，家兔腦出血模型給予病灶區羅格列酮灌注治療后，病灶周圍腦組織血腦屏障通透性減低及腦水腫、神經功能損害程度減輕，支持文獻報道，說明病灶區羅格列酮灌注對腦出血后繼發腦損傷有預防作用。

AQP-4是一種水通道蛋白，是大腦水通道的主要亞型，廣泛分布于軟膜下和室管膜下區及血管周圍星形膠質細胞終足上，呈明顯的極性分布[10]。AQP-4的主要作用是介導中樞神經系統水分子的跨膜轉運。在對體外培養的星型膠質細胞的研究表明，不表達AQP-4的星型膠質細胞水腫顯著減輕[11]。通過對原代培養的AQP-4基因敲除小鼠的星形膠質細胞進行觀察，顯示其對水的通透性下降了7倍,表明AQP-4可能是星型膠質細胞水轉運的主要途徑[12]。而且AQP-4對各種疾病導致的腦水腫形成和清除起重要作用，通過對AQP-4基因缺失轉基因小鼠的研究表明，AQP-4的表達加重細胞毒性腦水腫[13, 14]卻有利于血管源性腦水腫的清除[15]。AQP-4還參與維持血腦屏障通透性完整性和發育過程[16]。在對小鼠血管周圍星型膠質細胞研究表明，AQP-4的缺失和分布異常可導致星型膠質細胞終足腫脹，從而影響血腦屏障通透性結構和功能[17]。AQP-4基因敲除小鼠改變了血腦屏障通透性完整性[18]，然而Saadoun等[19]研究卻表明，AQP-4基因敲除對小鼠的血腦屏障通透性完整性沒有影響。也有研究[17]觀察到遠離損傷部位腦組織有AQP-4的減少但血腦屏障通透性沒有改變，因此認為AQP-4對沒有機械和代謝應激的正常腦組織血腦屏障通透性完整性不是關鍵因素。關于腦出血后AQP-4與腦水腫及血腦屏障通透性的關系的研究較少，且相關研究存在爭議。Chiu等[20]也認為，AQP-4表達下調導致腦出血后腦水腫加重和血腦屏障通透性增加；而Fang等[21]認為，在大鼠腦出血模型中，高壓氧治療通過降低AQP-4表達，從而減輕病灶周圍腦水腫發揮神經保護作用。研究表明，腦出血后腦組織水腫既涉及到血管源性腦水腫，又涉及到細胞毒性腦水腫，在腦出血的不同階段兩種水腫形式所占優勢不同[5]，因此AQP-4可能在不同階段發揮不同的作用。本研究發現家兔腦出血模型病灶周圍腦組織AQP-4表達顯著升高，且AQP-4表達水平與血腦屏障通透性、腦組織水腫及神經功能損害程度呈明顯相關性。本研究發現家兔腦出血模型病灶周圍腦組織AQP-4表達顯著升高，且AQP-4表達水平與血腦屏障通透性、腦組織水腫及神經功能損害程度呈明顯相關性。因此，我們推測腦出血后病灶周圍腦組織AQP-4表達增加，導致血腦屏障通透性增加，加重腦組織水腫，從而加重神經功能損害。但其在腦出血后腦損傷中的具體作用仍待使用AQP-4受體拮抗劑及細胞實驗等方法進一步驗證。