3例極早發炎癥性腸病患兒及其父母IL-10RA基因序列分析

張伯瑋,李揚,任靜,王鑫

天津醫科大學總醫院，天津300052

炎癥性腸病(IBD)主要包括潰瘍性結腸炎(UC)、克羅恩病(CD)和未分型結腸炎，以腹痛、腹瀉、便血和營養吸收障礙為主要特征，也有不典型癥狀的報道如新生兒期小腸廣泛壞死[1]。極早發IBD主要發生于6歲以前，且發病率逐漸增加，占兒童IBD的4%～10%[2～4]。極早發IBD以單基因異常為主，我國則以IL-10、IL-10RA及IL-10RB基因缺陷為主[5]。極早發IBD可因癥狀不典型而誤診、漏診，從而影響預后甚至危及生命。本研究中，我們檢測了3例極早發IBD患兒及其父母IL-10RA基因序列，并對其進行了分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年9月～2019年6月天津醫科大學總醫院精準醫學中心收治3例極早發IBD患兒，其中男2例、女1例，分別于生后7～11 d發病，其中1例(例1)于1月齡死亡，患兒父母于本院行遺傳咨詢；另2例于2～8個月因“腹瀉伴體質量不增、排黏液血便、擬行遺傳咨詢”就診于本院。3例患兒分別來自3個無親緣關系的家庭，父母健康，均非近親結婚。2例患兒(例1，2)為足月兒并經自然分娩，1例(例3)因羊水過少于38周剖腹產娩出，3例患兒家庭均無陽性家族史。

3例患兒分別于生后7～11 d以腹瀉及黏液血便起病，每日腹瀉十余次，均伴發熱；患兒炎性指標(C反應蛋白及血沉)均增高；患兒血培養、TORCH、便培養及大便輪狀病毒檢查等病原學檢查陰性；經抗感染治療患兒腹瀉未有顯著好轉；1例于生后7 d起病，伴高熱，抗感染治療后緩解不明顯，外院予“新生兒肺炎，非感染性腹瀉”診斷，予抗炎、利尿、強心及支持治療，逐漸出現口腔潰瘍、皮疹、肛周膿腫、重度貧血及重度營養不良，于1月齡因“新生兒肺炎，壞死性小腸結腸炎？”死亡。另外兩例分別于生后10 d及11 d起病，均存在口腔潰瘍及營養不良，均有糞鈣衛蛋白水平增高，其中1例有貧血及肛周膿腫。2例患兒分別行內鏡檢查，以結腸多發小潰瘍為主，病理以結腸炎癥、隱窩炎及隱窩膿腫為主要表現，當地醫院予“IBD”診斷。

1.2 IBD患兒及其父母基因序列分析 在知情同意的情況下，留取患兒及其父母靜脈血各2 mL，例1血樣為患兒父母于患兒死亡前留取并-20 ℃保存。使用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，生產批號DP318-03，離心柱型)提取患兒及父母外周血白細胞DNA。由NCBI網站下載IL-10、IL-10RA及IL-10RB基因DNA全序列(NM_000572、NM_001558、NM_000628)。采用Primer5軟件設計聚合酶鏈反應引物進行擴增。膠回收以及純化后，采用雙向測序法進行基因序列分析，然后與標準序列進行比對分析。

檢索千人基因組計劃資料庫(www.1000genomes.org)，對照患兒突變，濾過不致病的多態性位點。利用NCBI蛋白數據庫和Bioedit軟件進行人類和不同物種IL-10RA蛋白同源性比較，并運用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)及MutaitonTaster(http://www.mutationtaster.org)軟件進行突變的致病性預測。

根據文獻報道的125例經IL-10RA基因確診的我國極早發IBD患兒基因突變位點。結合本研究中的患兒基因突變位點制作我國IL-10RA基因突變譜。

2 結果

3例患兒于IL-10及IL-10RB基因未見明顯致病性突變。在IL-10RA基因中檢出3種突變，其中已知突變2種[c.299T>G(p.V100G)[6]、c.301C>T(p.R101W)[7]]，未經報道的新突變1種[c.326C>A(p.S109Y)]，于HGMD數據庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中未檢出。患兒父母均為突變的IL-10RA基因攜帶者。上述突變均導致IL-10-RA蛋白氨基酸序列改變，見表1、圖1。

經Polyphen-2、MutationTaster軟件預測及多物種同源性分析，3種突變位點(p.V100，p.R101及p.S109)高度保守，均很可能致病，見表2。中國極早發IBD患兒IL-10RA基因突變譜，見圖2、表3。

表1 3例極早發IBD患兒IL-10RA基因突變情況

3 討論

在我國極早發IBD中，IL-10軸，即IL-10、IL-10RA及IL-10RB基因缺陷較為常見[6, 7]。IL-10基因編碼IL-10，是一種免疫抑制因子，目前認為IL-10軸缺陷屬于自身免疫性疾病的一種，上述基因在維持腸道黏膜穩態中具有重要意義。正常生理條件下，IL-10由多種骨髓來源的細胞如T細胞、B細胞、單核細胞等分泌，被激活后可調節巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫相關細胞的促炎活性，其中樹突細胞是表達IL-10R水平最高的細胞。IL-10R是一種由2條不同的鏈組成的四聚體，即由IL-10RA基因編碼的IL-10受體A(IL-10RA)及由IL-10RB基因編碼的IL-10受體B(IL-10RB)[8]。IL-10與IL-10R的結合進一步激活Janus激酶1(JAK1)和酪氨酸蛋白質激酶2(TYK2)，繼而導致信號轉導和轉錄激活因子(STAT3)磷酸化。活化的STAT3在胞質內形成二聚體后入核，啟動核內DNA轉錄及后續抗炎的級聯反應，誘導抗炎基因的表達升高[9,10]。

注：例1存在c.301C>T(p.R101W)純合突變；例2存在c.301C>T(p.R101W)及c.326C>A(p.S109Y)復合雜合突變；例3存在c.301C>T(p.R101W)及c.299T>G(p.V100G)復合雜合突變。

圖1 3例患兒IL-10RA基因桑格爾測序結果

表2 IL-10RA蛋白物種間同源序列

表3 中國極早發IBD患兒IL-10RA基因熱點突變譜

注：共有22個突變被發現，分布于第2～6外顯子中；3，4外顯子為熱點突變區域；p.R101W及p.T179T是我國人群的熱點突變，p.V100G、p.R117H及p.R165X突變也較為常見。

注：ECD：細胞外區域；ICD：細胞內區域；TM：跨膜區域；SP：信號肽。

圖2 中國極早發IBD患兒IL-10RA基因突變譜

IL-10軸基因缺陷患兒發病極早。有報道對40例極早發IBD患兒進行遺傳學分析發現半數l歲以內起病的患兒中存在IL-10RA基因缺陷[11]。我國報道的極早發IBD患兒多為新生兒期起病的IL-10軸缺陷患兒[1]，與國外文獻報道較為一致。極早發型IBD常以遷延性腹瀉及結腸炎為主要表型，可伴隨腹痛、腹脹、黏液血便，生長發育遲滯，貧血、脫水、口角/口腔潰瘍及肛周病變等。肛周病變以腸皮膚瘺、直腸陰道瘺等瘺管形成及肛周膿腫為主[1, 4, 12]。極早發IBD的全身并發癥主要因營養障礙引發生長發育遲滯，炎癥引發反復感染，毛囊炎、皮疹及B細胞淋巴瘤可能與免疫異常相關，也有極早發IBD合并聽力損傷喪失的報道[13]。IL-10軸相關極早發IBD中，IL-10RB基因缺陷患者的手術率及B細胞淋巴瘤發生率相對較高[5]。極早發IBD易于誤診，如誤診為“細菌性腸炎、壞死性小腸結腸炎”等[7]。本研究中，3例患兒癥狀典型，以腹瀉起病，C反應蛋白及血沉等炎性指標異常，經抗感染、補液等支持治療后腹瀉緩解不明顯，1例未行腸鏡檢查，于外院考慮因“壞死性小腸結腸炎”死亡；例2及例3糞鈣衛蛋白水平增高，結合腸鏡及病理檢查結果，外院予“IBD”診斷，后于我院經遺傳學檢測確診。

IL-10軸相關極早發IBD內鏡下可見嚴重的結腸炎癥，以淺表及深部潰瘍為主，3歲以下的極早發IBD患兒常因臨床及內鏡下不典型癥狀而難以分型，可結合胃鏡檢查觀察上消化道是否受累從而進行鑒別診斷[14]。本研究中，患兒腸鏡以結腸黏膜炎癥及潰瘍為主，未見非干酪樣肉芽腫，不除外UC可能。一般認為極早發IBD患兒的自身抗體陽性率較低，且尚未發現特異性自身抗體[15]。本研究中，1例存在輕度抗核抗體及中性粒細胞抗體水平增高，1例抗體譜未發現明顯異常，1例未行相關檢測，提示抗體譜異常可能無典型臨床意義。

據報道，目前已知約60種基因與極早發IBD直接相關，大多數基因與免疫缺陷有關[14, 16]，我國極早發IBD以IL-10軸缺陷為主。在一項對130例IL-10軸患兒的臨床及遺傳學研究中，發現東亞人種患兒IL-10RA基因突變比例極高，約為98.7%，遠高于其他人種(47.6%)[5]。根據HGMD數據庫，目前IL-10RA基因已報道45種致病突變。IL-10RA基因c.C301T(p.R101W)和c.G537A(p.T179T)為東亞人群的熱點突變，約占70.3%和44.6%，顯著高于其他人種，且28.4%的非親源性患兒均具有相同的基因型，即IL-10RA基因p.R101W / p.T179T復合雜合突變[5]。

本研究共檢出IL-10RA基因的3個突變，其中p.R101W突變占4/6等位基因，進一步明確了該突變的高發。p.V100G也是中國極早發IBD患兒中較為常見的突變。p.S109Y是未曾報道的新突變，經家系分析及功能預測，考慮該突變致病可能性大。另外，在遺傳分析時，需要注意的是該基因有同義突變致病的報道，如p.T179T變異[17]。迄今為止，已有125例經IL-10RA基因確診的我國極早發IBD患兒被報道。結合本研究中的患兒，共報道23個突變。其中，p.R101W為最熱點突變(119/256等位基因)；p.T179T為次熱點突變(67/256等位基因)；另外，p.V100G、p.R117H、p.R165X在中國人群中也較為常見(分別占16/256、11/256及11/256等位基因)。

總之，本研究報道3例極早發IBD患兒，以遷延性腹瀉、黏液血便為主要表現，存在多種腸外并發癥。發現了3個IL-10RA基因突變，其中1個為新突變(p.S109Y)，且p.R101W突變在本研究的患兒中占4/6等位基因，符合既往文獻對熱點突變的研究。患兒父母均為上述突變IL-10RA基因的攜帶者。對新生兒期起病的不明原因的腹瀉，尤其伴隨黏液血便、貧血、肛周病變、口腔及口腔潰瘍的患兒，要考慮極早發IBD的可能，及早進行基因檢測。基因檢測在極早發IBD診斷及鑒別診斷中具有決定性作用。