黃芪抗腫瘤相關靶基因篩選、生物學功能分析及關鍵基因水平與非小細胞肺癌和乳腺癌預后的關系

張藝，陳丹

1天津醫科大學寶坻臨床學院,天津301800;2 天津醫科大學基礎醫學院

黃芪為豆科屬植物,多年生草本，分布于俄羅斯和我國內蒙古、山西、黑龍江等地區。黃芪味甘，性微溫，歸肺經、脾經,具有益氣、固表、促進組織再生、生津、消腫、祛瘀、養血、止汗及抗腫瘤等功效[1, 2]，主要化學成分包括黃芪甲苷、環黃芪素、多糖類、氨基酸類和黃酮類等。近年研究[3, 4]顯示，黃芪除具有抗菌、托毒、止汗等功效[2, 5]外，還具有一定的抗腫瘤作用。其抗腫瘤機制主要表現在調節機體免疫力、直接對腫瘤細胞產生抑制作用、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、調節體蛋白和氨基酸代謝等[6]。然而，關于黃芪抗腫瘤的具體分子機制并不清楚。2019年1～4月，本研究采用生物信息學分析方法篩選了黃芪抗腫瘤相關靶基因，分析了黃芪抗腫瘤相關靶基因生物學功能, 并探討了黃芪抗腫瘤關鍵基因表達水平與非小細胞肺癌和乳腺癌預后的關系。

1 材料與方法

1.1 數據來源 中醫大百科全書數據庫(ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html)；STRING數據庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)[7]；David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)；Kaplan-Meier數據庫(http://kmplot.com/analysis/)。

1.2 黃芪抗腫瘤相關靶基因篩選 在 ETCM中檢索抗腫瘤相關靶基因，檢索詞為：黃芪，腫瘤。檢索限制條件為：中草藥。對檢索出的相關靶基因名稱在DAVID數據庫中、基因功能注釋，選取與腫瘤相關的基因，對于注釋中與腫瘤無關的基因予以剔除。

1.3 黃芪抗腫瘤相關靶基因生物學功能及信號通路分析 采用David數據庫進行基因本體論(GO)分析黃芪抗腫瘤相關靶基因生物學功能，采用京都基因百科全書(KEGG)分析黃芪抗腫瘤相關靶基因信號通路。GO功能富集包括基因表達產物的定位，基因表達產物或分子的生物學過程以及富集基因表達產物分子功能。KEGG信號通路主要包括富集的基因相關代謝及功能的信號通路。

1.4 黃芪抗腫瘤相關靶基因相互作用分析及關鍵基因篩選 采用STRING數據庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)[7]對黃芪抗腫瘤相關靶基因編碼蛋白進行蛋白-蛋白相互作用網絡構建，物種選擇人，作用蛋白不少于20個，相互作用關系置信度大于0.4。采用Cytocscape在篩選出的黃芪抗腫瘤相關靶基因中選出關鍵基因，篩選條件為按照黃芪抗腫瘤相關靶基因基因編碼蛋白在蛋白相互作用網絡中與其他基因編碼蛋白的相互作用強弱進行排序，選取前3個蛋白編碼基因為關鍵基因。

1.5 黃芪抗腫瘤關鍵基因表達水平與腫瘤預后的相關分析 在Kaplan-Meier數據庫(http://kmplot.com/analysis/)中進行預后分析。Kaplan-Meier數據收錄了包括肺癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌等在內的多種腫瘤基因表水平與預后關系的數據。根據黃芪抗腫瘤相關靶基因編碼蛋白網絡中的關鍵基因mRNA在腫瘤中的表達水平，將相關腫瘤患者分為高、低表達組，Cox回歸模型Log-rank檢驗比較高低表達組腫瘤患總生存期，并計算風險比(HR)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪抗腫瘤相關靶基因、生物學功能及信號通路 黃芪抗腫瘤相關靶基因為TVAII、TOP2A、SHMT1、POLR2A、POLR2D、SHMT2、GLYA、PLA2G1B、SLC8A1、POLR2G、CROT、LSS、INS、PTR2、ARG1、GCVT、MTHFR、SHBG、PPGMK、TK、CYP1A1。黃芪抗腫瘤相關靶基因生物學過程：主要富集于谷氨酰胺代謝、嘌呤化合物、己糖轉運等；黃芪相關基因細胞成分：主要富集于氧谷氨酸脫氫酶復合物、過氧化物酶體和線粒體膜等；分子功能主要富集于氧化還原酶活性、羧基裂解酶活性和糖代謝等；KEGG信號通路主要富集于維甲酸信號通路、TP53調節代謝基因信號通路及葉酸代謝信號通路等。

2.2 黃芪抗腫瘤相關靶基因相互作用蛋白網絡及關鍵基因 STRING構建黃芪抗腫瘤基因編碼蛋白相互作用網絡，網絡中共21個相互作用蛋白，73個蛋白間相互作用關系，區域蛋白聚類指數為0.73，蛋白相互作用關系顯著(P<0.05)，見圖1A。網絡中關鍵基因包括POLR2A、POLR2D及POLR2G，見圖1B。

注：A：黃芪抗腫瘤相關靶基因編碼蛋白相互作用網絡；B：黃芪抗腫瘤相關靶基因編碼蛋白相互作用網絡中關鍵基因。

圖1 黃芪抗腫瘤相關靶基因相互作用網絡及關鍵基因

2.3 黃芪抗腫瘤關鍵基因表達水平與非小細胞肺癌乳、腺癌預后的關系 黃芪抗腫瘤關鍵基因POLR2A、POLR2D及POLR2G與非小細胞肺癌、乳腺癌預后關系見表1。POLR2D基因表達水平與非小細胞肺癌(HR=1.20,P=0.04)及乳腺癌(HR=1.40,P=0.04)存在相關性，見表1。

表1 黃芪抗腫瘤信號通路中關鍵基因與常見腫瘤預后關系

3 討論

據《本草綱目》記載“黃耆色黃，補藥之長”。中醫理論認為，黃芪具有補氣升陽、固表止汗等臨床功效，廣泛用于表虛自汗、氣虛內傷、精神萎靡、四肢無力、脾虛泄瀉、體虛多汗、氣虛脫肛、子官脫垂、浮腫及癰疽等病癥，用于治療心功能不全、腦卒中及感染性疾病等[8, 9]。近年有研究[10, 11]報道，黃芪具有增效減毒的臨床功效而被用于惡性腫瘤的相關輔助治療和術后康復。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分，藥理研究[12]已證實黃芪甲苷具有抗腫瘤活性。

本研究中我們在 ETCM中檢索出黃芪抗腫瘤相關靶基因主要為TVAII、TOP2A、SHMT1、POLR2A、POLR2D、SHMT2、GLYA、PLA2G1B、SLC8A1、POLR2G、CROT、LSS、INS、PTR2、ARG1、GCVT、MTHFR、SHBG、PPGMK、TK、CYP1A1等。POLR2A、POLR2D、POLR2G、LA2G1B為同一家族成員，生物學功能上具相似性。已有研究發現,POLR2A、POLR2D、POLR2G、LA2G1B與包括結直腸癌[13]、前列腺癌[14]等在內的多種腫瘤發生發展及惡性程度有關，提示和述基因在腫瘤的發生發展中可能具有重要作用。同時，我們通過生物信息學方法發現黃芪抗腫瘤作用可能與抑制上述基因表達有關，提示黃芪可能通過上述基因發揮抗腫瘤作用。

有文獻[4]報道，黃芪中的有效成分黃芪甲苷、多糖類、黃酮類等均可激活人體細胞核體液免疫系統，活化T細胞和NK細胞，同時促進單核巨噬細胞吞噬作用，從而達到抗腫瘤效果。本研究結果顯示，黃芪抗腫瘤相關靶基因生物學過程主要富集于谷氨酰胺代謝、嘌呤化合物、己糖轉運等；主要參與的細胞成分有氧谷氨酸脫氫酶復合物、過氧化物酶體和線粒體膜等；其分子功能主要與氧化還原酶活性、羧基裂解酶活性和糖代謝等有關。有研究[15]顯示，黃芪主要成分黃芪甲苷能夠通過PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌細胞的分裂，且其抑制程度與黃芪甲苷的濃度呈正相關。同時，黃芪可能通過谷氨酰胺代謝、嘌呤化合物、己糖轉運等影響腫瘤細胞的DNA合成和能量代謝，從而影響腫瘤細胞的增殖和凋亡。黃芪甲苷可直接抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞分化。本研究結果顯示，黃芪抗腫瘤相關靶基因主要參與維甲酸信號通路、TP53調節代謝基因信號通路及葉酸代謝信號通路等，與既往研究結果一致。說明黃芪主要抗腫瘤成分黃芪甲苷可通過PI3K/Akt、維甲酸、TP53及葉酸代謝，影響腫瘤細胞DNA合成等方式抑制腫瘤發展。

癌癥的發生與機體免疫力降低、細胞免疫監視功能減低有關。與正常細胞比較，腫瘤發生發展的重要機制之一為凋亡抑制，從而導致細胞不斷分裂增殖而不發生分化。黃芪可提高機體免疫力、誘導腫瘤細胞凋亡。體外研究[16]顯示，在肺腺癌細胞株A549中加入黃芪甲苷后細胞凋亡比例明顯上升，且G0/G1期細胞比例增高，提示黃芪甲苷具有明顯的促進腫瘤細胞凋亡和阻滯細胞周期的作用。本研究結果顯示，黃芪對宮頸癌，非小細胞肺癌、乳腺癌和胃癌等具有一定的抗腫瘤功效。參與黃芪抗腫瘤作用的關鍵基因包括POLR2A、POLR2D及POLR2G，且POLR2D基因高表達非小細胞肺癌和乳腺癌患者生存期較短，POLR2D基因有望成為非小細胞肺癌和乳腺癌患者預后分子標志物。近期研究[17]發現，α-鵝膏蕈堿為基礎的抗體共軛藥物可以以POLR2A基因為靶點有效治療結直腸癌小鼠。POLR2A是一種包括癌細胞在內的細胞生存的必需基因，該基因的過表達對于腫瘤細胞的增殖至關重要。因此，抑制POLR2A基因表達能夠有效抑制腫瘤的發展。POLR2D、POLR2G與POLR2A為同一家族成員，其生物學功能上可能具有相似性，但需要進一步證實。

綜上所述，中藥黃芪抗腫瘤關鍵基因主要有POLR2A、POLR2D、POLR2G等基因，其生物學功能主要與谷氨酰胺代謝等有關、細胞成分主要富集于氧谷氨酸脫氫酶復合物等、分子功能主要參與氧化還原酶活性等，KEGG信號通路主要富集于維甲酸信號通路等。黃芪抗腫瘤基因相互作用網絡中蛋白相互作用關系顯著。POLR2D高表達與非小細胞肺癌、乳腺癌患者生存期較短有關。然而，本研究也存在一定的局限性，文章從生物信息學技術入手對黃芪的生物學功能、相關基因信號通路及腫瘤預后關系進行了分析，但缺乏基礎生物實驗體內外證據。因此，下一步應進一步完善相關研究，從體內外分子水平進一步探討黃芪的生物學功能，為其臨床應用提供更為可靠的證據。