人冠狀病毒的研究現狀與進展

馬 洲，曹國君，關 明,3△

(1.復旦大學附屬華山醫院北院檢驗科，上海 201907；2.上海健康醫學院醫學技術學院，上海 201318； 3.復旦大學附屬華山醫院檢驗醫學科，上海 200040)

1 冠狀病毒概述

冠狀病毒(CoV)屬套氏病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬，為有包膜的正股單鏈RNA病毒，直徑為80～120 nm，約有3萬個堿基組成，其遺傳物質是已知RNA病毒中最大的。維持如此大的基因組有賴于其含有大量的3′-5′核糖核酸外切酶(ExoN)，ExoN的結構域在病毒進化和基因組擴展的過程中能夠糾正RNA的復制錯誤，維持病毒的穩定性[1]。冠狀病毒由核衣殼蛋白(N蛋白)、受體結合位點的刺突糖蛋白(S蛋白)、小包膜糖蛋白(E蛋白)、負責運輸營養物質的膜糖蛋白(M蛋白)、血凝素糖蛋白(HE蛋白)及核糖核酸(RNA)構成。國際病毒分類命名委員會在2012年根據其遺傳學差異和血清學特性將冠狀病毒分為α、β、γ、δ四群，其中β群冠狀病毒又進一步分為A、B、C、D四個組。α、β兩群易感染哺乳動物，包含了7種對人類致病的冠狀病毒，分別為HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2；而γ、δ兩群則主要感染禽類。

冠狀病毒是一種常見的、易引發呼吸道疾病的病原體。在引起成人社區獲得性肺炎的病毒中，冠狀病毒檢出率與其他呼吸道病毒的檢出率相似[2]。其整個感染過程包括吸附入侵、基因合成、成熟病毒包裝和病毒釋放4個步驟。病毒的吸附入侵取決于病毒受體的特異性，此過程主要依賴于病毒的S蛋白。S蛋白屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，可分為兩個結構域：受體結合亞基S1和膜融合亞基S2。在病毒入侵過程中，S1負責與宿主細胞表面的受體結合，然后病毒進行附著，S2負責融合宿主和病毒的細胞膜，使病毒基因組進入宿主細胞[3]，從而形成穩定的結合物，達到感染宿主細胞的目的。

2 冠狀病毒感染的臨床表現與感染途徑

目前已經發現7種致病性人冠狀病毒，它們能感染人類、牲畜和許多其他野生動物的呼吸系統、胃腸道、肝臟和中樞神經系統[4]。其中嚴重呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)曾在人群中大范圍傳播流行，證明了冠狀病毒在動物間、人與人之間傳播的可能性[5]。研究表明，蝙蝠身上能攜帶超過100多種病毒，是許多高致病性病毒的天然宿主，如狂犬病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒等，對人類社會造成巨大威脅的SARS-CoV正是來自中華菊頭蝠[6]。在中國云南的野外蝙蝠群體中寄生了很多種SARS樣冠狀病毒，這些病毒的基因重組，隨時可能導致下一次“SARS疫情”的發生[7]。2019年武漢疫情中發現的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)就屬于蝙蝠SARS樣冠狀病毒和MERS-CoV的病毒群，根據冠狀病毒的系統發生樹，SARS-CoV-2與bat-SL-CoVZC45(同源性達85%以上)關系密切[8]。研究顯示，蝙蝠攜帶的SARS樣冠狀病毒除了可利用來自人類、果子貍及中華菊頭蝠的血管緊張素轉換酶Ⅱ(ACE2)受體之外，還可利用來自浣熊犬ACE2受體分子入侵細胞。這意味著將有更多種的傳播途徑跨宿主感染人類[9]。同時，數據顯示ACE2不僅在肺AT2細胞中高表達，也在回腸和結腸的吸收腸上皮細胞中表達。因此消化系統是SARS-CoV-2除了呼吸系統外存在的另一條潛在傳播途徑[10]。除了呼吸道、消化道傳播途徑外，家庭聚集性傳播也是很重要的影響因素，有研究報告了1例1戶7人家庭中6人都罹患新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的案例，提示SARS-CoV-2具備人傳人的能力[11]。由于SARS-CoV的S蛋白和M蛋白具有極強的變異性，這為跨物種傳播提供了重要的物質基礎[12]，該病毒對于外界的抵抗能力和穩定性也強于一般的人冠狀病毒。MERS-CoV的中間宿主則是單峰駱駝，有20%的病例是由于患者接觸單峰駱駝所導致的[13]。除飛沫、直接接觸傳播之外，袁國勇教授的課題組用大量的實驗數據證明，糞-口傳播無論是在駱駝傳染人類還是人類之間的相互傳染中都是一條重要的MESR-CoV傳播新途徑[14]。

7種致病性人冠狀病毒中HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1主要引起相對溫和的急性上呼吸道感染癥狀，如咳嗽、發熱、咽喉痛、流鼻涕等，患者起病癥狀輕微，可無發熱癥狀，多數患者為輕、中度，預后良好。有研究表明，HCoV-HKU1易感染免疫力低下人群，如老人、兒童，尤其是患有基礎疾病的患者常因病情加重而住院[15]。而SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV這3種病毒引起的病癥則較為嚴重，在有原發疾病的前提下，會引起更嚴重的呼吸系統疾病，如急性呼吸窘迫綜合征[8]。由于SARS-CoV和SARS-CoV-2都是以其他生物的ACE2為受體以達到感染宿主的目的[16]，而ACEⅡ主要位于人肺部深處的肺細胞上，因此更易引發肺炎等重癥疾病。MERS-CoV的識別受體則為二肽激肽酶-4(DPP4)，DPP4受體細胞在下呼吸道中比較常見，在上呼吸道比較少見，就能解釋病毒為何更易導致肺部病變而不像一般感冒病毒那樣僅侵犯鼻咽部。SARS-CoV-2與SARS-CoV臨床癥狀極為相似，均會引起患者高熱、咳嗽、進行性呼吸困難及低氧血癥等癥狀，而胃腸道癥狀比較少見。研究表明只有43.8%的SARS-CoV-2感染者入院時存在發熱的癥狀，87.9%則在住院后出現發熱癥狀[17]。因此早期診斷時發熱并不能作為篩查標準，應結合CT檢查結果和其他臨床癥狀進行綜合判斷。組織病理學檢查中，患者肺部病變常表現為非特異性炎癥反應，肺泡上皮細胞嚴重脫落，肺泡間隔增寬，肺間質小動脈壁的損傷，都表明炎癥反應在整個疾病過程中起著重要作用，患者可因呼吸衰竭而死亡。MERS-CoV是繼SARS后的又一種能引發人類嚴重呼吸道感染甚至死亡的病原體，病例多集中在中東地區。MERS-CoV感染可產生高熱、寒戰、咳嗽、肌肉酸痛等癥狀，部分伴有腹瀉腹痛、惡心嘔吐等消化道癥狀。重癥病例可在肺炎的基礎上伴有其他并發癥，如肝、腎衰竭等,這可能與MERS-CoV的受體DPP4在人體中分布較為廣泛有關。與SARS-CoV患者相比，MERS-CoV患者的病死率更高,因為該病毒可感染患者體內的T淋巴細胞并誘導其凋亡。而SARS-CoV的受體為ACE2，且其在患者體內的表達量較少，因此SARS-CoV不會感染T淋巴細胞[18]。

3 冠狀病毒的檢測

目前冠狀病毒的檢測主要有兩個發展趨勢：方法的多樣性和多種方法互補聯合使用。冠狀病毒的主要檢測方法有細胞培養、血清學檢測、核酸檢測、電鏡檢測等，具體介紹如下。

3.1細胞培養 傳統的細胞分離培養是在體外模擬體內環境獲得大量細胞的過程，37 ℃模擬人體環境，待75%的細胞發生病變后，凍融細胞3次獲得病毒。可利用非洲猴腎傳代細胞(VERO E6)來培養SARS患者血液、糞便和呼吸道分泌物標本中的病毒[19]。細胞培養的優點：此法是病毒檢測的金標準，能順利進行下一步對細胞的信號轉導、合成代謝等特性的研究。缺點：多數細胞培養出現病變需要5～10 d[19]，培養周期長，靈敏度低且不易觀察，不能用于快速診斷，因此不能作為首選的檢測手段。

3.2血清學檢測 目前血清學檢測法包括免疫層析法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等[20]。

抗原、抗體檢測是臨床常用的初篩方法，例如免疫層析法和利用MERS-CoV的N蛋白建立的雙抗體夾心ELISA法[21]，通過采集患者標本與已知抗體發生特異性結合來檢測抗原。國際上常用的抗體檢測方法是ELISA，在抗原抗體結合反應的基礎上，利用酶催化和信號放大作用，借助光學儀器進行病毒陰、陽性的判斷。目前已有公司針對SARS-CoV-2研制出了POCT快速檢測試劑盒，運用免疫膠體金層析技術對患者血清或全血標本中的病毒IgM/IgG抗體進行體外定性檢測，可在15 min內得到結果。該方法的優點：試劑盒易于標準化和商品化，具有操作方便、快捷的特點，適用于隱性感染及大規模人群的篩查。同時，血清學檢測不僅能作為感染診斷依據，還可以用于體內特異性抗體的變化監測和既往感染規律、人群易感程度等流行病學數據研究，為疾病的防治與疫苗研發提供參考依據。缺點：需要已知的特異抗原、抗體成分，而病毒種類繁多，難以完全滿足抗原、抗體需求。而且從病毒的感染到抗體的產生存在窗口期，容易出現假陰性，檢測靈敏度相對較低。

3.3核酸檢測 核酸檢測具有靈敏度高、特異性強的特點，已成為冠狀病毒檢測的主流方法。目前對檢測區域的篩選和基因變異的分析是研究的重點，尤其是針對SARS-CoV、MERS-CoV這種具有巨大社會危害性的傳染性病毒。

針對病毒核酸的檢測，普遍應用的方法是實時熒光定量PCR法。它通過對標本中的特定核酸序列進行擴增獲得足夠的核酸數量后，通過熒光檢測等常規方法進行檢測[22]。除此之外，目前有研究基于Tn5轉染體具有直接分解RNA/DNA異源復合體的能力開發了一種轉錄組測序快速建庫方法——Sequencing HEteRo RNA-DNA-hYbrid(SHERRY)[23]。與已有的其他方法相比，其建庫的過程更簡單，標本的用量更少，不僅可以用于高質量的單細胞轉錄組測序，也可以用于目前正在肆意蔓延的SARS-CoV-2的檢測。牛培華等[24]在2014年建立了一種實時熒光定量PCR毛細管電泳儀，單管內同時實現檢測6種人類冠狀病毒的檢測，該檢測方法具有良好的特異性與靈敏度。耿合員等[25]發明了一種四重熒光定量檢測試劑盒，能夠同時檢測HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI 4種病毒，具有良好的檢測效果。這些試劑盒的出現使病毒的檢測更加的方便、高效，但是目前SARS-CoV-2 PCR試劑盒的檢測性能不盡人意。據2020年1月30日《人民日報》報道，天津1例新型冠狀病毒患者，經4次核酸檢測后才顯示核酸結果陽性[26]。有學者認為導致其陽性率低的因素有很多[22,27]，包括標本運輸及采樣不規范，核酸提取質量的差別，不同試劑盒之間的差異，擴增儀器的精密度，以及對于該病毒了解、認知較缺乏和無法進行定標質控等多方面因素。但并不能否定核酸檢測對于COVID-19的價值，國家衛生健康委員會公布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》中，核酸檢測仍是確診指標[28]。

3.4電鏡檢測 需要與其他方法相結合才能將電鏡觀察的優勢最大化，如人類呼吸道病原體在人呼吸道上皮細胞培養基上繁殖后，與電子顯微鏡觀察和全基因組測序相結合，能成功地檢測出SARS-CoV-2，并將其可視化。在此基礎上，研究者獲得了3個基因組，進一步設計了針對SARS-CoV-2基因組ORF1ab、n和e區的特異性、靈敏性較高檢測方法[29]，用于檢測臨床標本中的病毒RNA。電子顯微鏡檢測的優點：可直接觀察到病毒形態。缺點：需要先分離出病毒才能在鏡下觀察,且無法確認其基因型。

4 冠狀病毒感染患者的治療

對于冠狀病毒感染患者的治療，機制尚不明確，目前尚未研制出特效藥，現有的治療方案以對癥和支持治療為主。最近研究發現以下幾種藥物對冠狀病毒感染的治療有一定效果。

4.1腺苷類似物 腺苷類似物是一種化學合成的嘌呤和嘧啶類似物，在進入感染細胞后迅速被磷酸化，致使病毒的RNA聚合酶將藥物產生的核苷三磷酸摻入延伸的RNA鏈中，引起鏈延伸終止,從而抑制病毒的復制。目前用于治療慢性和急性病毒感染性疾病。例如BCX4430能夠直接發揮作用，對包括SARS-CoV和MERS-CoV在內的多種RNA病毒具有體外抑制活性[30]。

瑞德西韋(Remdesivir，又稱GS-5734)是一種具有藥理活性的核苷三磷酸，以病毒的RNA聚合酶為靶點，能有效阻止病毒的RNA復制，目前已證明對MERS-CoV感染的控制有效[31]。有研究顯示該藥物于治療感染病毒的恒河猴時，能夠提高其生存率達100%[31]。因此GS-5734是一種非常有前景的廣譜抗病毒藥物。目前有研究對利巴韋林、噴昔洛韋、硝唑尼特、萘伐他汀、氯喹、GS-5734和法匹拉維對SARS-CoV-2的抗病毒效果進行了分析。結果提示：GS-5734和氯喹在控制SARS-CoV-2感染方面是非常有效的[32]。

有研究者發現丙型肝炎病毒和冠狀病毒的病毒基因組復制的機制類似，由此推斷治療丙型肝炎的藥物索磷布韋/維帕他韋對包括SARS-CoV-2在內的冠狀病毒也可能有良好的抑制作用[30]。

4.2萘莫司他 萘莫司他是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑[33]，對于S蛋白介導的膜融合，如與跨膜蛋白酶絲氨酸2(TMPRSS2)與S蛋白的融合，具有強力的抑制作用。1%濃度的萘莫司他就能夠有效抑制MERS-CoV S蛋白介導的膜融合，從而達到阻止病毒感染宿主的目的。

4.3通過免疫機制治療 抗病毒藥物治療范圍狹窄，且容易產生耐藥性，因此疫苗和免疫治療是替代抗病毒藥物較好的備選方案，疫苗是防止病毒傳播的最佳保護措施，然而由于疫苗的開發要耗費大量的資金和時間，難度較大，因此利用自身免疫反應系統采取有效的治療措施顯得更加方便、快捷。

冠狀病毒入侵人體免疫系統，感染巨噬細胞并激活分化T細胞后，免疫細胞及組織細胞大量釋放細胞因子用于免疫反應擴增。在SARS患者肺間質浸潤性炎癥細胞中約有80%是CD8+T細胞，CD8+T細胞具有細胞毒性，能清除感染細胞中的冠狀病毒并誘導免疫損傷[34]，在抵抗病毒感染的過程中發揮重要作用。在病毒感染過程中，CD8+T細胞并不會受到SARS-CoV的影響，CD4+T細胞則易受到MERS-CoV感染[18]。還有研究表明，T細胞對S蛋白和其他結構蛋白的反應具有持久性，此特點為將來疫苗的研發提供了突破口[35]。

4.4干擾素、抑制劑 干擾素是宿主的主要抗病毒分子，能夠抑制病毒的傳播，發揮免疫調節作用，促進巨噬細胞對抗原的吞噬。因此，干擾素的產生對病毒在宿主體內能否存活有直接影響[35]。研究發現應用干擾素β1b聯合霉酚酸對MERS-CoV具有體外抗病毒活性，可以為MERS患者提供更具針對性的治療方案[36]。

洛匹那韋-利托那韋——一種用于治療艾滋病毒的蛋白酶抑制劑，在體外試驗中也顯示對MERS-CoV有抑制作用[37]。目前針對SARS-CoV-2開展的洛匹那韋和利托那韋聯合應用的隨機對照試驗已經在指定醫院展開，以評估洛匹那韋和利托那韋聯合應用于SARS-CoV-2感染住院患者的療效和安全性。

4.5SARS-CoV-2治療方案 鑒于SARS-CoV-2是一種新出現的病毒，尚未開發出特效藥，除了應用上述提到的抗病毒藥物以外，目前以吸氧和輔助對癥為主，有38%的患者接受了吸氧治療[17]。輕、中度患者應當注意隔離和臥床休息，監測各項指標，維持體內環境的穩定，留意血氧飽和度變化，根據相關實驗室數據及時調整治療方案。例如，有細菌感染出現時要及時給予抗菌治療，但要避免盲目的抗菌藥物治療，尤其是廣譜抗菌藥物的聯合應用要慎重。危重癥病例的治療原則是在對癥治療的基礎上，防止并發癥和繼發性感染，并進行器官功能支持，同時，要注意加強患者的心理疏導，避免產生恐懼焦慮等負面情緒的影響。

5 冠狀病毒感染的預防

針對冠狀病毒的感染，目前尚缺乏有效的疫苗，因此了解其傳播途徑，并采取有效的預防措施至關重要。SARS-CoV-2致病性要低于SARS[29]，其死亡病例大多是有原發疾病且免疫力低下的人群，但其傳播能力極強，有模型預測，武漢感染患者可能高達75 800例[38]。目前被SARS-CoV-2感染的患者中，約26%的患者未去過武漢或接觸武漢相關人員[17]，所以無法排除“超級傳播者”的存在，因此切斷傳播途徑、保護易感人群是目前能夠控制疫情的最佳方案。SARS-CoV-2與2003年SARS疫情相似，都與出售野生動物和肉類的市場有關[29]。這給人們深刻的警示：未來要進一步規范市場管理，養成良好的生活習慣，一旦發現疫情，應及時切斷傳染源，把疫情控制在最小的范圍內然后及時將其“消滅”[38]。疫情期間不參加群體類活動，減少外出，防止發生聚集性感染事件，外出應正確佩戴口罩。加強室內空氣的流通，勤洗手，保持個人良好的衛生習慣，不食用生食，盡量不接觸野生動物，注重鍛煉，增強體質和自身免疫力。此外，就醫時應做好防護措施，避免交叉感染，醫護人員要采取分級防護原則，避免院內感染的發生，上述措施有助于控制疫情進一步擴散。

6 展 望

由于冠狀病毒的感染者缺乏特異性癥狀和體征，目前其致病機制還有待研究，缺乏有效的檢測方法，以及特效藥物，疫苗的研究尚處于初級階段。但冠狀病毒具有較強的傳染性和致病性，治療難度大，目前主要以對癥支持治療為主，難以取得理想的治療效果。此外，由于冠狀病毒是一種RNA病毒，相應的錯配修復機制不完善，易發生變異。冠狀病毒很可能會在頻繁的變異中獲得新的特性，例如感染新的宿主細胞類型或物種，將來可能會暴發新的疫情。冠狀病毒感染不僅會對人類的生命安全構成威脅，還會對全球社會經濟造成極大損失，需要“未雨綢繆”，積極應對。同時應對其流行病學和致病機制進行深入研究，積極研發新型特效藥和疫苗，并開發出更有效的檢測手段，把冠狀病毒的威脅扼殺于“搖籃”階段。