嗜水氣單胞菌穿梭質粒載體p BKPU01的構建、表達和鑒定

張 莉，張小蒙

（江蘇醫藥職業學院藥學院，江蘇鹽城 224005）

0 引言

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發性致病菌［1］，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌［2］，嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，多數菌株對氟哌酸、菌必治敏感，嗜水氣單胞菌表現多種抗性［3］，其中一個主要原因是含有多種質粒［4］。本實驗室從嗜水氣單胞菌中分離得到一種質粒，命名為質粒pBK760，該質粒具有多種位點和抗性，具有良好的載體特征。

pMD20是一種高效克隆PCR產物的專用載體［5］。該載體以pUC19載體為基礎，在其多克隆位點處的Xba I和BamH I位點之間增加了Spe I，Nde I，EcoRV3種酶切位點，經EcoR V酶切后再在兩側的3’端添加“T”制備而成［6］。因大部分耐熱性DNA聚合酶進行PCR反應時都有在PCR產物的3’端添加一個“A”的特性，可以大大提高PCR產物的連接、克隆效率［7］。

雖然質粒pBK760和pMD20均可單獨作為載體來使用，但是如果可以將其優點相結合，就可以發揮它們各自的優勢，本實驗就結合質粒pBK760和pMD20兩方面的優點，利用現代技術構建了一種全新的穿梭質粒載體（pBKPU01），便于開展相關基因功能研究和遺傳育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和載體

質粒pBK760由本實驗室從嗜水氣單胞菌中分離并保存，pMD20購自大連寶生物。

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購自大連寶生物；凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自上海生工；其他常規試劑為進口或國產分析純。

1.2 引物設計與合成

根據質粒pBK760序列，采用Oligo 6.0軟件設計1對特異性引物P1、P2，上游引物P1序列為：ATCGTCGACCCTCTAGATGCAG，下游引物P2序列為：CTGACTCTAGCAGGTCGAGGAT。引物由上海生工合成。

1.3 質粒pBK760的提取

挑取嗜水氣單胞菌單菌落，接種于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37℃培養12 h。菌液用質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒pBK760，-20℃儲存待用。

1.4 質粒pBK760線性化

以質粒pBK760為模板，通過設定引物（P1和P2）進行PCR，使環狀質粒pBK760線性化，PCR的具體反應條件如表1所示。

反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 4.5 min，32循環；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR擴增后的產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將檢驗正確的片段純化回收。

1.5 質粒pBK760和載體pMD20的連接

將線性化質粒pBK760和載體pMD20進行連接，反應體系如表2所示。

操作步驟如下：16℃連接過夜，取2.5μL連接產物轉化50μL E.coli DH5α感受態細胞，取100μL菌液涂布含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板進行藍白斑篩選。挑取陽性轉化子，轉入5 mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基，37℃培養12 h，用質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒，獲得穿梭質粒載體pBKPU01。

表1 質粒p BK760線性化PCR反應具體條件

表2 質粒p BK760和載體p MD20連接體系

1.6 轉化、酶切驗證和分析

制備嗜水氣單胞菌感受態細胞，用電轉化方法轉化感受態細胞［8］，用質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒，通過HindⅢ和EcoRⅠ進行雙酶切驗證。結果證明的確是質粒pBKPU01，說明構建的穿梭載體pBKPU01能夠在嗜水氣單胞菌中復制表達。確定重組質粒后進行測序分析（華大基因），序列分析結果和質粒pBK760序列相同，驗證正確。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

以P1、P2為引物，以質粒pBK760為模板進行PCR擴增，凝膠電泳結果如圖1所示，成功擴增出長度為3 817 bp的質粒pBK760，與預期結果一致，可進行下一步實驗。

2.2 pBKPU01單、雙酶切鑒定

對轉化并提取的質粒pBKPU01通過HindⅢ和EcoRⅠ進行單、雙酶切驗證，酶切后均得到6 000 bp左右的片段，其他片段過小未能顯示，與預期結果一致，凝膠電泳結果如圖2所示。

2.3 pBKPU01圖譜構建

以DNAMAN為工具［9］，構建pBKPU01圖譜，圖譜如圖3所示。該穿梭質粒載體包括位于3 355～3 561的啟動子位點、位于3 726～3 812的信號肽編碼基因、位于1 592～2 363的卡那霉素抗性基因、位于2531～2735的博來霉素抗性基因，位于347～676的lacZ基因以及位于1 833～2 693的氨芐青霉素抗性基因。

3 討論

圖1 質粒p BK760經PCR線性化后的凝膠電泳

圖2 轉化E.coli DH5α后提取的穿梭質粒載體p BKPU01單、雙酶切鑒定電泳

圖3 穿梭質粒載體p BKPU01圖譜

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發性致病菌，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌，嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，多數菌株對氟哌酸、菌必治敏感，嗜水氣單胞菌表現多種抗性，其中一個主要原因是含有多種質粒，本實驗室從嗜水氣單胞菌中分離得到一種質粒，命名為質粒pBK760，該質粒具有多種位點和抗性，具有良好的載體特征。

pMD20是一種高效克隆PCR產物的專用載體。該載體以pUC19載體為基礎，在其多克隆位點處的Xba I和 BamH I位點之間增加了 Spe I，Nde I，EcoR V3種酶切位點，經EcoR V酶切后再在兩側的3’端添加“T”制備而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進行PCR反應時都有在PCR產物的3’端添加一個“A”的特性，可以大大提高PCR產物的連接、克隆效率［10-13］。

雖然質粒pBK760和pMD20均可單獨作為載體來使用，但是如果可以將其優點相結合，就可以發揮它們各自的優勢，本研究就結合質粒pBK760和pMD20兩方面的優點，利用現代技術構建了一種全新的穿梭質粒載體（pBKPU01），便于開展相關基因功能研究和遺傳育種工作。