流式細胞影像系統（Flow CAM）在海洋微型浮游生物群落結構研究中的應用發展

韓留玉 陳綿潤

【摘 要】微型浮游生物是海洋生態系統中最基本的組成部分。近年來，海洋微型浮游生物群落在海洋生態系統中的地位和作用越來越得到人們的關注，這與微型浮游生物觀測技術的發展以及它們在海洋生態系統中的應用有著密切的關系。流式細胞影像系統（Flow CAM）是近年來發展起來的浮游生物生態學研究方法，通過結合流式細胞術和顯微鏡技術，能夠實現浮游生物的自動分類，提高微型浮游生物樣品的分析效率。

【關鍵詞】微型浮游生物;Flow CAM;自動分類

1海洋微型浮游生物的研究進程

近年來，由于海洋顯微觀測技術的發展，使得生物學家能夠觀察到越來越小的海洋微型浮游生物，進而對它們的分類、生理生態學、種群增長率、營養行為以及在微食物環中的作用研究越來越多。

目前國際上通常所說的海洋微型浮游生物包括微型真核自養生物、微型真核異養生物、微型原核自養生物和微型原核異養生物等單細胞生物以及浮游病毒等多個類群。近年來的研究表明，海洋微型浮游生物在海洋生態系統中的作用尤其是生產力中的作用越來越重要，在海洋生態系統中的生物地球化學循環和能量代謝中發揮著越來越重要的作用。

定量檢測微型浮游生物的種群動態變化，不僅有利于研究其種間營養關系，更有助于探索其在海洋生態系統中所起的重要作用。傳統顯微計數方法雖然可以通過形態特征觀察不同類型的微生物來分別計數，但費時費力，人為誤差較大。流式細胞攝像系統（Flow CAM）的應用，使得這些問題迎刃而解。

2海洋微型浮游生物觀測技術的發展

（1）顯微鏡計數法

顯微鏡法是最傳統的細胞計數方法。通常用網具采集樣品并用固定劑固定后帶回實驗室，在顯微鏡下計數。其優點是計數結果準確，可以從物種水平對形態多樣性和不規則的浮游生物進行鑒定。但耗時耗力，對操作人員的專業知識及能力要求比較嚴格，計數結果的人工主觀性誤差比較大。

（2）浮游生物光學計數器計數法

浮游生物光學計數器（OPC）簡便快捷、計數效率高，并且能通過遮擋相同數量光線的球的直徑來表示顆粒物的大小，因而得到廣泛使用。浮游生物激光計數器（LOPC）在OPC的基礎上進行了技術上的改進，將最小粒徑擴展到100μm，在海洋生態系統研究中應用比較廣泛。

（3）流式細胞儀計數法

流式細胞儀的出現實現了快速、大批量的分析，但不能得到浮游生物直觀圖像。對于粒徑小于50μm和大于100μm的顆粒難于操作，且數據重復性低，難以用于現場監測。

（4）圖像拍攝技術分析法

最早的流體成像系統是利用感光膠片和計算機等控制圖像和閃存來實現的。隨著計算機和圖像獲取技術的發展，系統逐漸向包含圖像、分析和顆粒技術的方向發展。浮游生物視頻記錄器（VPR）的出現使海洋顆粒物的現場檢測成為可能。

（5）流式細胞攝像系統（Flow CAM）分析法

流式細胞攝像系統（Flow CAM）綜合了顯微鏡技術和流式細胞術技術。實現了浮游生物的快速檢測與自動分類，減少了人工操作，解決了大規模尺度研究下數據獲得相對滯后的問題。在快速檢測的同時得到浮游生物的直觀形態學圖像，測定顆粒粒徑范圍擴展到了3-3000μm。既能在實驗室內進行樣品分析，又可以在野外進行連續24小時實時監測，分析樣品的數量和速度得到提升。

3流式細胞攝像系統（Flow CAM）的工作原理和流程

流式細胞攝像系統（Flow CAM）包括主機和計算機工作平臺兩部分，由三個子系統構成：流控系統、光學系統和電學系統。流控系統是蠕動抽水泵將待分析的樣品導入流通池，通過調節蠕動抽水泵的速度調節樣品經過流通池的速度，流通池根據浮游顆粒物的大小分為不同的規格，用以得到顆粒物的清晰圖像。光學系統包括閃頻LED光源、熒光探測器和其他一些光學部件。電學系統主要是控制整個設備的運轉、獲取圖像信號以及數據處理等。

Flow CAM的基本工作流程包括：（1）物鏡及對應流通池的安裝;（2）掃描樣品，獲得圖像及相應的顆粒物信息;（3）建立浮游生物圖像數據庫;（4）利用Visual Spreadsheet軟件對已經分析的樣品進行自動識別和分類，獲得不同浮游生物類群的豐度。

4流式細胞攝像系統（Flow CAM）在微型浮游生物分類鑒定工作中的應用

流式細胞攝像系統（Flow CAM）是近年來發展起來的一種先進的檢測儀器，主要用于快速檢測海洋、湖泊、河流等各種水體中的有機和無機懸浮體。Flow CAM在國外海洋研究中的應用較多，在我國只有個別學者利用Flow CAM檢測海洋浮游植物物種并建立圖譜庫。目前我國運用流式細胞攝像系統建立圖譜庫，來對海洋微型以及超微型浮游生物群落多樣性的研究以及它們在海洋生態系統中的研究鮮有報道。入海口和近海海灣是我國赤潮的高發區，而且是重要的漁業生產基地，微型浮游生物種群的變動間接影響著漁業資源的興衰和分布，部分赤潮種的爆發將會對漁業生產產生不可估量的危害，微型浮游生物種群多樣性的變化可以指示海域環境的改變情況，對入海口和近海海灣海域微型浮游生物主要類群建立多參數圖譜庫，不僅可以實現對沿海海域的微型浮游生物實現實時監控，從而通過種群的變動判斷被檢測海域環境的變化，而且對于漁業養殖海域赤潮種的快速檢測與預警，以及近海漁業資源的分布具有一定的指導意義。

5流式細胞攝像系統（Flow CAM）應用于海洋微型浮游生物分類工作中的局限性和展望

流式細胞攝像系統（Flow CAM）在國外已經獲得廣泛應用，但在技術上仍存在一些不足，目前應用于海洋浮游生物鑒定和分類工作方面仍存在很大的瓶頸。首先系統對參數的設計還不夠全面，尤其是多細胞不規則形態的類群，不能有效的展現所有類群細胞生物的形態特征，如何將多細胞群體分割成單一細胞，直接給出單個細胞的相關參數是需要解決的問題。其次，自動分類仍然需要人工操作的輔助，目前只達到了半自動分類，后續的鑒別工作還需要人工去完成，對時間的節約不是那么的顯著。再次，對細胞生理方面的特征信息的獲取還有待開發。相信隨著圖像分析技術的不斷完善，流式細胞攝像系統（Flow CAM）在技術方面會不斷的優化和完善，在海洋生態系統的研究也會越來越廣泛。

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基金項目：

國家海洋局南海分局海洋科學技術局長基金資助項目（1602）。

（作者單位：1.國家海洋局海口海洋環境監測中心站;2.國家海洋局南海規劃與環境研究院）